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Ⅰ.कोलेजन क्या है

कोलेजन एक बायोपॉलिमर है, जो जानवरों के संयोजी ऊतक का मुख्य घटक है, और स्तनधारियों में सबसे प्रचुर और व्यापक रूप से वितरित कार्यात्मक प्रोटीन भी है, जो कुल प्रोटीन का 25% -30% और यहां तक ​​कि कुछ में 80% से अधिक तक होता है। जीव. यह जंतु कोशिकाओं में ऊतक को जोड़ने की भूमिका निभाता है।

माप के अनुसार, एक वयस्क के शरीर में लगभग 3 किलोग्राम कोलेजन होता है, जो मुख्य रूप से त्वचा, हड्डियों, आंखों, दांतों, टेंडन, आंतरिक अंगों (हृदय, पेट, आंत और रक्त वाहिकाओं सहित) और अन्य भागों में मौजूद होता है। मानव शरीर का. इसका कार्य त्वचा और अंगों की आकृति विज्ञान और संरचना को बनाए रखना है, और यह क्षतिग्रस्त ऊतकों की मरम्मत के लिए एक महत्वपूर्ण कच्चा माल भी है।

द्वितीय. अल्ट्राफिल्ट्रेशन द्वारा ग्रास कार्प स्केल से कोलेजन का निष्कर्षण

1. सामग्री और विधियाँ

1.1 परीक्षण नमूने

कच्चे कोलेजन का जलीय अर्क।

1.2 परीक्षण विधियाँ

1.2.1 अल्ट्राफिल्ट्रेशन प्रक्रिया

1.2.2 पूर्व निस्पंदन प्रक्रिया का निर्धारण

इस परीक्षण में, वैक्यूम निस्पंदन विधि और माइक्रोफिल्ट्रेशन विधि के तुलनात्मक विश्लेषण के माध्यम से इष्टतम पूर्व-निस्पंदन प्रक्रिया निर्धारित की जाती है। विशिष्ट परीक्षण विधियाँ इस प्रकार हैं:

① कच्चे कोलेजन जलीय अर्क को जलीय अर्क में निलंबित कणों और अशुद्धियों को हटाने के लिए फिल्टर पेपर वैक्यूम निस्पंदन विधि द्वारा फ़िल्टर किया जाता है।

② कच्चे कोलेजन जलीय अर्क को जलीय अर्क में अघुलनशील पदार्थों, अशुद्धियों आदि को हटाने के लिए 0.2 μm माइक्रोफिल्ट्रेशन झिल्ली के साथ फ़िल्टर किया जाता है।

1.2.3 अल्ट्राफिल्ट्रेशन झिल्ली छिद्र आकार का विकल्प

शुद्धिकरण के दौरान, अल्ट्राफिल्ट्रेशन झिल्ली का छिद्र आकार 100 kDa होता है।

1.2.4 अल्ट्राफिल्ट्रेशन शुद्धिकरण प्रक्रिया का एकल कारक प्रयोग

क्रूड कोलेजन के जलीय अर्क को अल्ट्राफिल्ट्रेशन तकनीक द्वारा शुद्ध किया जाता है। कोलेजन प्रतिधारण पर ऑपरेटिंग दबाव, ऑपरेटिंग तापमान और पीएच के प्रभाव के एकल कारक प्रयोग का अध्ययन करें। कुछ समय के लिए अल्ट्राफिल्ट्रेशन उपकरण शुरू करने के बाद, कोलेजन प्रतिधारण दर पर विभिन्न कारकों के प्रभाव का अध्ययन करें।

1.2.5 गणना सूत्र

2. परिणाम और विश्लेषण

2.1 पूर्व-निस्पंदन प्रक्रिया विश्लेषण

वैक्यूम निस्पंदन विधि और माइक्रोफिल्ट्रेशन विधि के तुलनात्मक परिणामों के लिए नीचे दी गई तालिका देखें।

निस्पंदन विधि	निस्पंदन से पहले समाधान एकाग्रता/(जी/एल)	निस्पंदन के बाद समाधान एकाग्रता/(जी/एल)	संवेदी घटना
वैक्यूम निस्पंदन विधि	0.45	0.35	निस्पंदन के अंत में समाधान स्पष्ट होता है, लेकिन कुछ समय तक छोड़े जाने के बाद यह गंदला हो जाता है।
माइक्रोफिल्ट्रेशन विधि	0.45	0.42	निस्पंदन के अंत में समाधान स्पष्ट होता है और कुछ समय तक छोड़े जाने के बाद भी स्पष्ट रहता है

 

तालिका से देखा जा सकता है कि वैक्यूम निस्पंदन विधि और माइक्रोफिल्ट्रेशन विधि दोनों घोल में अशुद्धियों और अघुलनशील ठोस पदार्थों को हटा सकते हैं, लेकिन माइक्रोफिल्ट्रेशन विधि का प्रोटीन पर बेहतर सुरक्षा प्रभाव पड़ता है, यानी नुकसान महत्वपूर्ण नहीं है, और वैक्यूम निस्पंदन विधि से प्रोटीन को नुकसान हो सकता है। इसके अलावा, वैक्यूम निस्पंदन द्वारा कुछ समय तक रखे जाने के बाद निस्पंदन धुंधला हो जाता है, जबकि माइक्रोफिल्ट्रेशन अभी भी स्पष्ट और पारदर्शी होता है, इसलिए माइक्रोफिल्ट्रेशन को अल्ट्राफिल्ट्रेशन की पूर्व-उपचार प्रक्रिया के रूप में चुना जाता है।

2.2 अल्ट्राफिल्ट्रेशन प्रक्रिया का एकल कारक परीक्षण

2.2.1 अवधारण दर पर अल्ट्राफिल्ट्रेशन दबाव का प्रभाव

तापमान 40 डिग्री और पीएच 9.{3}} की स्थिति के तहत, विभिन्न अल्ट्राफिल्ट्रेशन दबावों (0.07एमपीए, 0) के प्रभावों का अध्ययन करें। {11}}प्रोटीन प्रतिधारण दर पर 9एमपीए, 0.11एमपीए, 0.13एमपीए और 0.15एमपीए)। परिणाम नीचे दिए गए चित्र में दिखाए गए हैं।

 

जैसा कि उपरोक्त आंकड़े से देखा जा सकता है, ऑपरेटिंग दबाव में वृद्धि के साथ, प्रोटीन की अवरोधन दर धीरे-धीरे कम हो गई। {0}}.07एमपीए पर, प्रोटीन प्रतिधारण दर 96.53% है, जब ऑपरेटिंग दबाव 0.15एमपीए है, तो प्रोटीन प्रतिधारण दर 84.38% है। ऐसा इसलिए है क्योंकि अल्ट्राफिल्ट्रेशन द्वारा पदार्थों का पृथक्करण दबाव अंतर से प्रेरित होता है। कम ऑपरेटिंग दबाव की उस सीमा में, छोटे आणविक पदार्थ जल्दी से झिल्ली से गुजर सकते हैं, लेकिन मैक्रोमोलेक्यूलर पदार्थ अल्ट्राफिल्ट्रेशन झिल्ली द्वारा फंस सकते हैं और झिल्ली की सतह पर जमा हो सकते हैं, और इस समय, झिल्ली की सतह और जलीय पदार्थ एकाग्रता अंतर ध्रुवीकरण प्रतिरोध का कारण बनने के लिए फॉर्म एकाग्रता अंतर निकालें; हालाँकि, दबाव बढ़ने के साथ, सांद्रता ध्रुवीकरण प्रतिरोध धीरे-धीरे बढ़ता है, और झिल्ली की सतह और जलीय अर्क के बीच सांद्रता अंतर संतुलन तक पहुँच जाता है। जब दबाव इस संतुलन से अधिक हो जाता है, तो झिल्ली की सतह पर एक जेल परत लिखी जा सकती है (जो एकाग्रता ध्रुवीकरण और अल्ट्राफिल्ट्रेशन के दौरान गठित जेल परत के सिद्धांत के अनुरूप थी)। दबाव बढ़ता रहता है, और जेल परत की मोटाई बढ़ जाती है, और झिल्ली की सतह पर शेष प्रोटीन बढ़ जाता है, जिसके परिणामस्वरूप अवधारण दर कम हो जाती है। झिल्ली के पृथक्करण प्रभाव को सुनिश्चित करने के लिए, इष्टतम ऑपरेटिंग दबाव पैरामीटर 0.07MPa है।

2.2.2 प्रोटीन प्रतिधारण दर पर तापमान का प्रभाव

दबाव की स्थिति के तहत {0}}.11एमपीए, पीएच 9.0, प्रोटीन प्रतिधारण पर विभिन्न तापमानों (25 डिग्री, 30 डिग्री, 35 डिग्री, 40 डिग्री और 45 डिग्री) के प्रभावों का अध्ययन करें। परिणाम नीचे दिए गए चित्र में दिखाए गए हैं।

 

जैसा कि उपरोक्त आंकड़े में दिखाया गया है, तापमान में वृद्धि के साथ, अल्ट्राफिल्ट्रेशन झिल्ली की अवधारण दर धीरे-धीरे बढ़ती है, और यह अधिकतम 45 डिग्री तक पहुंच जाती है, अवधारण दर 97.01% है। क्योंकि कोलेजन की चिपचिपाहट तापमान से निकटता से संबंधित होती है: जब तापमान कम होता है, तो कोलेजन की चिपचिपाहट अधिक होती है, और इस प्रकार कोलेजन झिल्ली की सतह पर प्रतिरोध बनाना आसान होता है, जिसके परिणामस्वरूप कम अवधारण दर होती है। जब तापमान बढ़ता है, तो कोलेजन की चिपचिपाहट कम हो जाती है और कोलेजन अणुओं के बीच परस्पर क्रिया कमजोर हो जाती है, जिससे द्रव्यमान स्थानांतरण दर बढ़ जाती है, और एकाग्रता ध्रुवीकरण कमजोर हो जाता है, जिससे प्रतिधारण दर बढ़ जाती है। अवधारण दर में वृद्धि का एक अन्य कारण यह है कि तापमान बढ़ता है, और कोलेजन की घुलनशीलता तदनुसार बढ़ जाती है, और झिल्ली को अवरुद्ध करने वाले कोलेजन की घटना कम हो जाती है। इसलिए, अल्ट्राफिल्ट्रेशन के लिए इष्टतम तापमान 45 डिग्री है।

2.2.3 प्रोटीन प्रतिधारण पर पीएच का प्रभाव

दबाव {0}}.11एमपीए और तापमान 40 डिग्री की स्थिति के तहत, विभिन्न पीएच स्थितियों, अर्थात् पीएच=6.0, पीएच{ के प्रभावों का अध्ययन करें। अवधारण दर पर {5}}। परिणाम नीचे दिए गए चित्र में दिखाए गए हैं।

 

As shown in the above figure, within the pH value range of 6–7, with the increase of pH value, the protein retention rate decreases, and there is a minimum value of 82.13% at pH=7.0. When pH>7, with the increase of pH value, the retention rate gradually increases. This is because the isoelectric point of collagen pH=7, at the isoelectric point of protein is a precipitation state, easy to stay on the surface of the membrane block membrane, so that the retention rate is low; When pH>7, पीएच की वृद्धि के साथ अवधारण दर धीरे-धीरे बढ़ती है। ऐसा इसलिए है क्योंकि अल्ट्राफिल्ट्रेशन झिल्ली नकारात्मक चार्ज के साथ पॉलीथर मेपल झिल्ली है, क्षारीय स्थिति के तहत नकारात्मक चार्ज के साथ कोलेजन, नकारात्मक चार्ज वाले कोलेजन अणु और एक ही चार्ज के साथ अल्ट्राफिल्ट्रेशन झिल्ली एक परस्पर अनन्य स्थिति बनाते हैं, जिससे कोलेजन अणुओं को सतह पर रहना आसान नहीं होता है झिल्ली की, झिल्ली को अवरुद्ध करना आसान नहीं है, इसलिए अल्ट्राफिल्ट्रेशन का इष्टतम pH 8-10 है।

2.3 अल्ट्राफिल्ट्रेशन प्रक्रिया अनुकूलन और परिणाम सत्यापन

डिज़ाइन-एक्सपर्ट8.05 सॉफ़्टवेयर द्वारा विश्लेषण से पता चलता है कि इष्टतम प्रक्रिया पैरामीटर इस प्रकार हैं: ऑपरेटिंग दबाव 0.14MPa, ऑपरेटिंग तापमान 40.98 डिग्री, और समाधान pH=9.43। इन शर्तों के तहत, अवधारण दर 92.551% थी। वास्तविक मापदंडों की संचालन क्षमता को ध्यान में रखते हुए, ऑपरेटिंग दबाव 0.14MPa है, ऑपरेटिंग तापमान 40 डिग्री है, और अल्ट्राफिल्ट्रेशन स्थितियों के तहत फ़ीड तरल का पीएच मान 9.50 है। अल्ट्राफिल्ट्रेशन डिवाइस का सिस्टम स्थिर होने के बाद प्रायोगिक सत्यापन शुरू किया जाता है। प्राप्त अवधारण दर परिणाम (92.61 0.1)% (n=3) है। समीकरण का अनुमानित मूल्य मूल रूप से मापा मूल्य के समान है, जो इंगित करता है कि अनुमानित सशर्त पैरामीटर परिणाम वास्तविक सशर्त परिणाम के अनुसार है।

2.4 वैद्युतकणसंचलन विश्लेषण परिणाम

शुद्ध कोलेजन का विश्लेषण एसडीएस-पेज इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा किया जाता है, और परिणाम नीचे दिए गए चित्र में दिखाए गए हैं।

जैसा कि उपरोक्त चित्र में दिखाया गया है, लेन 1 इस प्रयोग में शुद्ध कोलेजन है और लेन 2 बछड़ा कण्डरा का मानक कोलेजन नमूना है। एसडीएस-पेज वैद्युतकणसंचलन से यह देखा जा सकता है कि इस प्रयोग में प्रस्तावित कोलेजन प्रोटीन को कोलेजन के रूप में पहचाना जा सकता है, लेकिन ए1 पेप्टाइड श्रृंखला और ए2 पेप्टाइड श्रृंखला की स्पष्ट रूप से अस्पष्ट सीमाएं स्पष्ट नहीं हैं। वैद्युतकणसंचलन से यह स्पष्ट है कि कोई अन्य प्रोटीन बैंड नहीं हैं, और यह निष्कर्ष निकाला जा सकता है कि शुद्ध कोलेजन की शुद्धता अधिक है।