अल्ट्राफिल्ट्रेशन ट्यूब के उपयोग के लिए सावधानियां

(1) उपयुक्त अल्ट्राफिल्ट्रेशन ट्यूब का चयन करें। आम तौर पर, बनाए रखा जाने वाला आणविक भार लक्ष्य प्रोटीन के आणविक भार के 1/3 से अधिक नहीं होना चाहिए। उदाहरण के लिए, यदि लक्ष्य प्रोटीन का आणविक भार 35kDa है, तो 10kDa आणविक भार वाली अल्ट्राफिल्ट्रेशन ट्यूब का चयन किया जा सकता है। यदि लक्ष्य प्रोटीन का आणविक भार लगभग 10kd है, तो 3KD के आणविक भार के साथ एक अल्ट्राफिल्ट्रेशन ट्यूब का उपयोग किया जा सकता है। निर्देश पुस्तिका को ध्यान से पढ़ें और विभिन्न रसायनों के लिए अल्ट्राफिल्ट्रेशन झिल्ली की विभिन्न सहिष्णुता पर ध्यान दें।

(2) नया खरीदा हुआ अल्ट्राफिल्ट्रेशन सूखा है। उपयोग करने से पहले अल्ट्राप्योर पानी डालें, और पानी पूरी तरह से झिल्ली से गुजर जाएगा। इसे कुछ मिनट के लिए बर्फ के स्नान या रेफ्रिजरेटर में पहले से ठंडा कर लें। फिर पानी निकाल दें और प्रोटीन का घोल डालें। जोड़ी गई राशि ट्यूब के शीर्ष पर सफेद रेखा से अधिक नहीं होनी चाहिए। ऑपरेशन हल्का होना चाहिए। प्रोटीन समाधान जोड़ने से पहले, अल्ट्राफिल्ट्रेशन ट्यूब को प्रीकूलिंग के लिए बर्फ पर डालने की आवश्यकता होती है।

(3) संतुलन। द्रव्यमान और गुरुत्वाकर्षण केंद्र दोनों संतुलित होने चाहिए। ध्यान दें कि गति और त्वरण बहुत तेज नहीं होना चाहिए, अन्यथा अल्ट्राफिल्ट्रेशन झिल्ली सीधे क्षतिग्रस्त हो जाएगी। केन्द्रापसारक अल्ट्राफिल्ट्रेशन शुरू करें (4 डिग्री के लिए अपकेंद्रित्र प्रीकूलिंग)। विभिन्न सेंट्रीफ्यूज के RPM को G में बदलने के बाद, यह अलग है। झिल्ली पर दबाव को कम करने के लिए अपकेंद्रित्र के त्वरण को निम्नतम गियर में समायोजित करें। ध्यान दें कि अपकेंद्रित्र छोड़ने से पहले आपको तब तक प्रतीक्षा करनी चाहिए जब तक कि अपकेंद्रित्र लक्ष्य गति तक न पहुँच जाए, अन्यथा जब अपकेंद्रित्र के साथ कोई समस्या हो, तो आप पहली बार में इससे निपट नहीं सकते। झिल्ली और घूर्णन शाफ्ट की दिशा निर्देशों के अनुसार समायोजित की जानी चाहिए (कोण घूर्णन अपकेंद्रित्र के मामले में, झिल्ली शाफ्ट के लंबवत है)। व्यावहारिक उपयोग में, गति आमतौर पर मैनुअल की तुलना में कम होती है, जो केन्द्रापसारक पाइप के सेवा जीवन को लम्बा खींच सकती है।

(4) जब यह शेष 1 मिलीलीटर पर केंद्रित हो जाए, तो 50ul बफर घोल लें और 10ul जोड़ें ताकि यह नीला हो जाए, ताकि यह पता चल सके कि अल्ट्राफिल्ट्रेशन ट्यूब प्रोटीन का रिसाव करती है या नहीं। यदि ट्यूब लीक हो जाती है, तो ऊपरी परत डालें और नई ट्यूब से प्रवाहित करें और अल्ट्राफिल्ट्रेशन शुरू करें। ट्यूब लीक हो रही है या नहीं, इसका सटीक आकलन करने के लिए, 10 मिनट के लिए 5mgml BSA के साथ सेंट्रीफ्यूज करें, फिर प्रवाह लें, मोटे माप के लिए प्रोटीन गोंद या ब्रैडफोर्ड चलाएं, और एकाग्रता के लिए शेष प्रोटीन समाधान जोड़ना जारी रखें (प्रोटीन को होने से रोकने के लिए बर्फ पर काम करें) गरम) जब तक सभी केंद्रित समाधान नहीं जोड़े जाते। सेंट्रीफ्यूजेशन के दौरान प्रोटीन वर्षा होती है या नहीं, इस पर ध्यान दें, जिसके परिणामस्वरूप पाइप ब्लॉकेज हो जाता है। यदि वर्षा होती है, तो वर्षा का विशिष्ट कारण निर्धारित करें, चाहे प्रोटीन की सांद्रता बहुत अधिक हो या बफर अनुपयुक्त हो; पूर्व को एकाग्रता को कम करने के लिए कई अल्ट्राफिल्ट्रेशन ट्यूबों के साथ एक साथ अल्ट्राफिल्ट्रेशन द्वारा हल किया जा सकता है। उत्तरार्द्ध विभिन्न बफर समाधानों को तब तक बदलना है जब तक कि प्रोटीन अवक्षेपित न हो जाए।

(5) पिछले चरणों का उपयोग प्रोटीन को केंद्रित करने के लिए किया जाता है। यदि आप बफर को बदलना चाहते हैं, जब कुल प्रोटीन समाधान लगभग 1ml पर केंद्रित होता है, तो धीरे से एक नया बफर जोड़ें (0.22um अल्ट्राफिल्ट्रेशन झिल्ली के माध्यम से अल्ट्राफिल्ट्रेशन), और फिर लगातार तीन बार लगभग 1ml पर ध्यान केंद्रित करें। अंतिम सांद्रता की अंतिम मात्रा आवश्यक प्रोटीन सांद्रता पर निर्भर करती है, जो आमतौर पर 500ul से अधिक नहीं होती है, या इसे 200ul से कम पर केंद्रित किया जा सकता है। हर बार कम से कम 10 गुना की मात्रा के अनुसार, यह तीन बार 1000 गुना से अधिक तक पहुंच सकता है, जो मूल रूप से बफर को बदलने के उद्देश्य को प्राप्त कर सकता है।