सारांश:

यह लेख दो प्रमुख कारकों की समीक्षा करता है जिन्हें प्रोटीन शुद्धि रणनीतियों में माना जाना चाहिए: डाउनस्ट्रीम एप्लिकेशन आवश्यकताओं और प्रोटीन की जैविक विशेषताओं। लेख इस बात पर जोर देता है कि उच्च गुणवत्ता वाले प्रोटीन शुद्धि प्रयोगात्मक डेटा की विश्वसनीयता और पुनरावृत्ति के लिए नींव है, विशेष रूप से पुनः संयोजक प्रोटीन के उत्पादन के लिए। विभिन्न अनुप्रयोग परिदृश्यों में प्रोटीन शुद्धता, गतिविधि या एंडोटॉक्सिन सामग्री के लिए विशिष्ट आवश्यकताएं होती हैं, और प्रोटीन विशेषताएं शुद्धि रणनीतियों को काफी प्रभावित कर सकती हैं। विशिष्ट मामलों के अनुसार, लेख बताता है कि अद्वितीय प्रोटीन को अनुकूलित शोधन योजनाओं को अपनाना चाहिए। अंत में, एक व्यवस्थित प्रोटीन उत्पादन प्रक्रिया प्रस्तावित की गई थी (चित्रा 1), अभिव्यक्ति प्रणालियों के चयन से पूर्ण-प्रक्रिया गुणवत्ता नियंत्रण पर जोर देते हुए, शुद्धि अनुकूलन के लिए निर्माण डिजाइन, और बायोफिज़िकल तकनीकों (जैसे कि एसईसी-मल, डीएसएफ, आदि) के माध्यम से प्रोटीन समरूपता और कार्यक्षमता के मूल्यांकन की सिफारिश करना। इस लेख का उद्देश्य शोधकर्ताओं के लिए व्यावहारिक मार्गदर्शन प्रदान करना है, जिससे उन्हें लक्ष्य प्रोटीन की विशेषताओं और अनुप्रयोग आवश्यकताओं के आधार पर कुशल और दोहराने योग्य शुद्धि रणनीतियों को तैयार करने में मदद मिलती है, जिससे वैज्ञानिक अनुसंधान की गुणवत्ता और दक्षता बढ़ जाती है।

 

चित्रा 1। प्रोटीन उत्पादन प्रक्रिया का योजनाबद्ध आरेख

 

उच्च -मांग प्रोटीन उत्पादन - समस्या पहचान के उदाहरण, शमन रणनीति डिजाइन और इसी आउटपुट

 

1. एन्यूक्लिक एसिड प्रोटीन के लिए बाध्यकारी:

न्यूक्लिक एसिड बाइंडिंग प्रोटीन को शुद्ध करते समय, न्यूक्लिक एसिड संदूषण को हटाने के लिए कई चरणों की आवश्यकता होती है। Lysis के दौरान, न्यूक्लियस (जैसे SM Nuclease (Benzonase®) या DNase या RNase) को जोड़ा जाना चाहिए, लेकिन बाध्य न्यूक्लिक एसिड को पूरी तरह से हटाया नहीं जा सकता है। न्यूक्लिक एसिड हटाने के चरणों को बदलें, जैसे कि पीईआई या स्ट्रेप्टोमाइसिन सल्फेट वर्षा, हेपरिन शुद्धि या आयन-एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी। न्यूक्लिक एसिड की उपस्थिति की निगरानी A26 0 nm/a28 0 nm के अनुपात से की गई थी। यदि अनुपात 0.6 से कम था, तो यह संकेत दिया कि प्रोटीन शुद्धता अपेक्षाकृत अधिक थी और न्यूक्लिक एसिड संदूषण न्यूनतम था। दृढ़ता से बाध्य न्यूक्लिक एसिड के साथ प्रोटीन के लिए, उन्हें अस्थायी रूप से विघटित किया जा सकता है (जैसे कि यूरिया के साथ इलाज किया जाता है) और फिर पुनर्जागरण किया जा सकता है। मुख्य बिंदु: उच्च गुणवत्ता वाले अभिकर्मकों, ताजा बफ़र्स और स्वच्छ कॉलम (उपयोग से पहले 0.5m NaOH के साथ साफ) का उपयोग करें।

 

2। माउस फेरिटिन भारी श्रृंखला:

शुद्ध माउस फेरिटिन हेवी चेन (MFTH1) प्रोटीन का उत्पादन करने का उद्देश्य उच्च-रिज़ॉल्यूशन सिंगल-कण क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो-ईएम) है। Escherichia कोलाई अभिव्यक्ति वेक्टर एन्कोडेड Unlabeled MFTH1 को किसी भी न्यूक्लियस को जोड़ने के बिना अल्ट्रासोनिक रूप से बाधित किया गया था। 7 0 डिग्री पर हीटिंग के बाद, यह अमोनियम सल्फेट वर्षा, डायलिसिस और आकार के बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी चरणों से गुजरता है। परिणामी नमूने ने क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी छवियों (चित्रा 2 ए) में बड़ी मात्रा में दूषित पदार्थों की उपस्थिति को दिखाया, जो इसके आवेदन के लिए पूरी तरह से अनुपयुक्त था। चरणों का अनुकूलन करें। अमोनियम सल्फेट वर्षा के बाद सेल lysis प्रक्रिया और डायलिसिस प्रक्रिया के दौरान एसएम न्यूक्लियस जोड़ें, और फिर A26 0 NM/A280NM के अनुपात को 1.4 से 0.8 तक कम करने के लिए आयनों एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी चरण को जोड़ें। आकार के बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी के बाद, अंतिम MFTH1 नमूने के A260NM/A280NM का अनुपात 0.56 था। एसडीएस-पेज और क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी छवियों (चित्रा 2 बी) ने दिखाया कि प्रोटीन बहुत शुद्ध था, यह दर्शाता है कि दूषित पदार्थों को प्रभावी ढंग से हटा दिया गया था।

चित्रा 2 माउस फेरिटिन भारी श्रृंखला

 

 

 

3। काइमेरिक प्रोटीन मानव DSRBEC (DSRBD-EGF- चिमेरा):

DSRBEC का गठन मानव प्रोटीन kinase R और मानव एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर (HEGF) के डबल-फंसे हुए RNA बाइंडिंग डोमेन (DSRBD) के संलयन से होता है। जब DSRBD को Escherichia Coli में व्यक्त किया जाता है, तो यह एक अत्यधिक उच्च dsRNA बाध्यकारी क्षमता दिखाता है। सेल lysis के बाद, दूषित आरएनए निश्चित धातु आयन आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी (IMAC) स्तंभ के लिए पुनः संयोजक प्रोटीन के बंधन में बाधा डालेगा। PEI या स्ट्रेप्टोमाइसिन सल्फेट वर्षा, RNase उपचार या उच्च-नमक बफर समाधान जैसे पारंपरिक तरीके RNA को नहीं हटा सकते हैं। सेल lysis को 4M यूरिया वाले एक बफर का उपयोग करके किया गया था। सतह पर तैरनेवाला एक iMac कॉलम पर लोड किया गया था, और 4m से 0 m यूरिया को धीरे -धीरे रात भर (स्तंभ रेनटेशन) का उपयोग किया गया था। रेनटेशन बफर को imidazole के साथ जोड़ा गया था और iMac स्तंभ से eluted किया गया था। कार्यात्मक रूप से सक्रिय DSRBEC प्राप्त करने के लिए अंतिम शोधन सुपरडेक्स 75 जेल निस्पंदन के माध्यम से किया गया था।

 

4। प्रोटीन को विभाजित करना या अन्य कोफ़ैक्टर्स के लिए बाध्य:

प्रोटीन के लिए जो zn 2+, fe 2+, cu 2+, या अन्य cofactors जैसे divalent cations के साथ बातचीत करते हैं, अभिव्यक्ति के दौरान विशिष्ट divalent cations (या अन्य cofactors) को जोड़ना महत्वपूर्ण है। शुद्धिकरण प्रक्रिया के दौरान एक ही divalent cations (या अन्य cofactors) की एक छोटी मात्रा की भी आवश्यकता होती है। हालांकि, किसी भी chelating एजेंटों (जैसे EDTA, EGTA) और Chelating कम करने वाले एजेंटों (जैसे DTT या DTE) का उपयोग से बचा जाना चाहिए। जब डाइवेंटल केशन से बंधे प्रोटीन के साथ काम किया जाता है, तो स्पेक्ट्रोस्कोपिक तरीकों (जैसे परमाणु अवशोषण स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री) के माध्यम से शुद्ध प्रोटीन में डाइवेंटल केशन (या अन्य कोफैक्टर्स) की वास्तविक उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए, चेल्टिंग एजेंटों के बिना प्रोटीज इनहिबिटर के मिश्रण का उपयोग किया जाना चाहिए।

 

5। पुनः संयोजक फेरिडॉक्सिन (आरएफडी) जिसमें थर्मोफिलिक साइनोबैक्टीरिया मास्टिगोक्लैडस लैमिनोसस से एक एकल [2FE ± 2S] क्लस्टर होता है

फेरिडॉक्सिन एक घुलनशील लोहे-सल्फर प्रोटीन है जो इलेक्ट्रॉन ट्रांसफर प्रतिक्रियाओं में भाग लेता है। प्लांट-टाइप फेरोरेडॉक्सिन फोटोसिस्टम I. के इलेक्ट्रॉन स्वीकर्ता के रूप में एक एकल [2fe ± 2S] क्लस्टर को वहन करता है। Escherichia कोलाई BL21 (DE3) तनाव ने 10 मिमी FECL3 और एंटीबायोटिक्स युक्त टीबी माध्यम में पुनः संयोजक RFD प्रोटीन व्यक्त किया। IMAC कैप्चर कॉलम का क्षालन इमिडाज़ोल से बचने के लिए 10 मिमी हिस्टिडीन युक्त एक बफर का उपयोग करके किया गया था और [2fe ± 2S] क्लस्टर के विनाश को रोकने के लिए। क्रिस्टलीकरण स्क्रीनिंग के लिए 12mg/ml के लिए आगे शुद्धिकरण और एकाग्रता के लिए आयनों विनिमय और आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी का उपयोग किया गया था। फेरोरेडॉक्सिन के पुनः संयोजक उत्पादन की तुलना में, नीले-हरे शैवाल मास्टिगोक्लैडस लैमिनोसस से शुद्ध किए गए प्राकृतिक फेरोरॉक्सिन ने क्रिस्टलीकरण के दौरान उच्च संकल्प प्राप्त किया।

 

6। एंटीजन के रूप में इस्तेमाल किया जाने वाला प्रोटीन

लक्ष्य-विशिष्ट लिगैंड्स को पुनर्प्राप्त करने के लिए अक्सर एंटीजन के रूप में प्रोटीन का उपयोग किया जाता है। पहली बात यह है कि क्या पारंपरिक मोनोक्लोनल या पॉलीक्लोनल आईजीजी प्राप्त करने के लिए, या कैमल आईजीजी या इन विट्रो चयन प्रक्रियाओं में कार्यक्रमों के लिए प्रोटीन का उपयोग विवो प्रतिरक्षा में किया जाता है।

 

6.1 एंटीजन नियमित एंटीबॉडी उत्पादन के लिए उपयोग किया जाता है

जब एंटीजन का उपयोग मोनोक्लोनल आईजीजी एंटीबॉडी का उत्पादन करने के लिए किया जाता है, तो एंटीजन का सही तह आमतौर पर आवश्यक नहीं होता है, क्योंकि अधिकांश मोनोक्लोनल एंटीबॉडी रैखिक एपिटोप्स को पहचानते हैं जो एंटीजन की संरचना से बहुत प्रभावित नहीं होते हैं, और यहां तक ​​कि अव्यवस्थित एंटीजन (जैसे कि समावेश शरीर के प्रोटीन) भी प्रभावी होते हैं। हालांकि, प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के साथ हस्तक्षेप करने वाले मजबूत इम्युनोजेनिक दूषित पदार्थों से बचने के लिए शुद्धता को सख्ती से नियंत्रित किया जाना चाहिए और गैर-लक्ष्य एंटीबॉडी के प्रभुत्व का कारण बनता है।

 

6.2 संयुग्म लाइब्रेरी की स्क्रीनिंग

ऊंट टीकाकरण द्वारा प्राप्त नैनोबोडी लाइब्रेरी के प्रसंस्करण के दौरान एंटीजन के प्राकृतिक विरूपण को बनाए रखने के लिए विशेष ध्यान दिया जाना चाहिए। पारंपरिक एंटीबॉडी के विपरीत, ऊंट एंटीबॉडी (विशेष रूप से नैनोबॉडी) संरचनात्मक एपिटोप्स को पहचानते हैं, जो उनके अद्वितीय उत्तल पूरक साइट संरचना से संबंधित है। इसी तरह, जब इन विट्रो में बड़े सिंथेटिक या प्राकृतिक एंटीबॉडी पुस्तकालयों की स्क्रीनिंग की जाती है, तो एंटीजन को एक संरचना को बनाए रखना चाहिए जो पूरी तरह से लक्ष्य अनुप्रयोग के अनुरूप हो। चूंकि स्क्रीनिंग प्रक्रिया स्वयं गैर-पक्षपाती है, अगर एंटीजन में मिसफोल्डिंग, एकत्रीकरण या अनुरूपता विषमता है, तो गैर-प्राकृतिक एपिटोप्स को लक्षित करने वाले संयुग्मों की एक बड़ी संख्या को बाहर निकाल दिया जा सकता है।

 

 

 

7। प्रोटीन जिसमें इंटरमॉलेक्युलर या इंट्रामोल्युलर डाइसल्फ़ाइड बॉन्ड या फ्री सिस्टीन होते हैं

प्रोटीन की प्राकृतिक संरचना को स्थिर करने के लिए डाइसल्फ़ाइड बॉन्ड महत्वपूर्ण हैं। शुद्धिकरण प्रक्रिया के दौरान, जब इंटरमॉलिक्युलर या इंट्रामोल्युलर डाइसल्फ़ाइड बॉन्ड वाले प्रोटीन को शुद्ध करते हैं, तो प्रोटीन के रूपांतरण परिवर्तनों को रोकने के लिए एजेंटों को कम करने से बचने के लिए आवश्यक है, जिससे उनके कार्यों को बदल दिया जाता है। मुक्त सिस्टीन युक्त प्रोटीन के लिए, एजेंटों को कम करने के लिए शोधन प्रक्रिया के सभी चरणों में अपरिहार्य हैं, विशेष रूप से भंडारण के दौरान, कृत्रिम डाइसल्फ़ाइड बॉन्ड के गठन को रोकने के लिए। सबसे अधिक उपयोग किए जाने वाले एजेंटों को कम करने वाले डीथियोथ्रिटोल (DTT), -MercaptoEthanol (-me), और Tris (2- कार्बोक्जाइथाइल) फॉस्फीन हाइड्रोक्लोराइड (TCEP) हैं। IMAC रेजिन के लिए जो DTT या TCEP के साथ असंगत हैं, यह -me का उपयोग करने और बाद के चरणों में अन्य कम करने वाले एजेंटों के साथ उन्हें बदलने की सिफारिश की जाती है।

 

8। पुनः संयोजक एंटीबॉडी टुकड़ा

यद्यपि पुनः संयोजक एंटीबॉडी टुकड़ों (जैसे नैनोबॉडीज) की संरचना आईजीजी की तुलना में सरल है, उनका कार्य डाइसल्फ़ाइड बॉन्ड के सही गठन पर निर्भर करता है। बैक्टीरियल अभिव्यक्ति प्रणालियों में, यहां तक ​​कि अनुकूलन रणनीतियों को अपनाने के साथ, मिसफॉल्ड या आंशिक रूप से मुड़े हुए उत्पाद अभी भी हो सकते हैं, जो घुलनशील भाग और समावेशी निकाय दोनों में मौजूद हैं। अधिक छुपा हुआ है कि यहां तक ​​कि सही ढंग से मुड़े हुए एंटीबॉडी टुकड़े सतह पर हाइड्रोफोबिक सजीले टुकड़े के माध्यम से घुलनशील समुच्चय (कोलाइड एकत्रीकरण) बना सकते हैं। इस तरह के समुच्चय को नियमित कार्यात्मक परीक्षणों (जैसे एलिसा) में पहचानना मुश्किल है क्योंकि बहु-बाध्यकारी बंधन मोनोमर आत्मीयता में गिरावट को मुखौटा कर सकता है, लेकिन उनकी उपस्थिति उन अनुप्रयोगों को गंभीरता से प्रभावित कर सकती है जो छोटे अणु आकार (जैसे कि सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी) पर भरोसा करते हैं। इसलिए, केवल एसडीएस-पेज पर भरोसा करना नमूना गुणवत्ता का मूल्यांकन करने के लिए अपर्याप्त है। जेल निस्पंदन (चित्रा 3) जैसे बायोफिज़िकल तरीकों को एग्रीगेट्स (बहिष्करण वॉल्यूम चोटियों) से मोनोमर्स (मुख्य चोटियों) को अलग करने के लिए अपनाया जाना चाहिए। प्रमुख नियंत्रण बिंदुओं में शामिल हैं: डाइसल्फ़ाइड बॉन्ड गठन को बढ़ावा देने के लिए अभिव्यक्ति के दौरान रेडॉक्स वातावरण का अनुकूलन करना, और एकत्रीकरण को रोकने के लिए शुद्धि के बाद भंडारण की स्थिति का अनुकूलन करना। एंटीबॉडी टुकड़ों के मोनोडिस्पर्सिटी और कार्य को सुनिश्चित करने के लिए ये उपाय महत्वपूर्ण हैं।

चित्रा 3। नैनोबॉडी के घुलनशील समुच्चय का जेल निस्पंदन पृथक्करण

 

9। लिम्फोसाइट रिसेप्टर LLT1 के घुलनशील टुकड़े

डाइसल्फ़ाइड बॉन्ड-डिपेंडेंट प्रोटीन (जैसे लिम्फोसाइट रिसेप्टर LLT1) की पुनः संयोजक अभिव्यक्ति अक्सर तह कठिनाइयों का सामना करती है। जंगली-प्रकार LLT1 के जेल निस्पंदन ने एकत्रीकरण चोटियों और डिमर चोटियों (चित्रा 4 ए) को दिखाया, लेकिन द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री ने डिमर (चित्रा 4 बी) में अप्रकाशित सिस्टीन के कारण होने वाली मिसफॉल्डिंग का पता चला। इस उद्देश्य के लिए, दो म्यूटेंट को डिजाइन किया गया था: एक ने समस्या को हटा दिया, जिसके परिणामस्वरूप उपज में अचानक गिरावट आई (चित्रा 4 ए); संकुचित डाइसल्फ़ाइड बॉन्ड को फिर से बनाने के लिए नियोसिस्टीन की शुरूआत के बाद, उत्परिवर्ती में न केवल एक उच्च उपज और अच्छी स्थिरता थी, बल्कि क्रिस्टलीकृत (चित्रा 4 सी) भी हो सकती है, और 3 डी संरचना ने पुष्टि की कि उत्परिवर्ती ने सही डाइसल्फ़ाइड बंधन का गठन किया और प्राकृतिक तह को बनाए रखा। यह मामला दर्शाता है कि तर्कसंगत रूप से डिजाइन करके, जेल निस्पंदन और द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के साथ संयुक्त रूप से अनुरूप डाइसल्फ़ाइड बॉन्ड, पुनः संयोजक प्रोटीन की तह समस्या को प्रभावी ढंग से हल किया जा सकता है, और स्थिर संरचनाओं और उच्च पैदावार के साथ कार्यात्मक प्रोटीन प्राप्त किया जा सकता है।

चित्रा 4। डाइसल्फ़ाइड बॉन्ड पुनर्निर्माण घुलनशील LLT1 की तह और उपज में सुधार करता है

 

 

 

10। आसानी से कुल प्रोटीन

पुनः संयोजक प्रोटीन की शुद्धि अक्सर एकत्रीकरण की समस्या का सामना करती है, और इसका गठन "न्यूक्लिएशन-ग्रोथ" तंत्र का अनुसरण करता है-घुलनशील समुच्चय की एक छोटी मात्रा पहले बनती है और फिर बड़े पैमाने पर अघुलनशील एकत्रीकरण को ट्रिगर करती है। इस चुनौती को संबोधित करने के लिए, बहु-स्तरीय रणनीतियों को अपनाने की आवश्यकता है: अभिव्यक्ति चरण में, यह तनाव को अनुकूलित करके, संस्कृति के तापमान को कम करके, संशोधित संस्कृति मीडिया या अलग-अलग सॉल्यूबिलाइजिंग फ्यूजन प्रोटीन का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है, और अभिव्यक्ति प्रणालियों (कीट/स्तनधारी कोशिकाओं) को बदलने के लिए, "एक 4 डिग्री के रूप में (एक 4 डिग्री के वातावरण में) की आवश्यकता होती है। SEC) को कुल नाभिक को तुरंत हटाने के लिए अपनाया जाना चाहिए। सामान्यतया, जब बफर सॉल्यूशंस की स्क्रीनिंग करते हैं, तो घटक रचना, पीएच मूल्य, विघटित एजेंट या सॉलुबिलाइज़र जैसे कारकों को ध्यान में रखा जाना चाहिए (चित्र 5)। ऑर्थोगोनल डिटेक्शन (जैसे कि एसईसी, सीडी, एलएस, डीएसएफ और तापमान शिफ्ट के आधार पर प्रतिदीप्ति गर्मी, आदि) के ठीक अनुकूलन के माध्यम से, प्रोटीन की गुणवत्ता और सबसे उपयुक्त बफर समाधान निर्धारित किए गए थे।

चित्रा 5। प्रोटीन एकत्रीकरण को कम करने के लिए रणनीतियाँ

 

11। मानव CLK1 KINASE का क्रिस्टलीकरण (प्रजनन योग्य बैच कैसे प्राप्त करें)

क्रिस्टलीकरण अध्ययन के लिए सजातीय गैर-फॉस्फोराइलेटेड CLK1 किनसे प्राप्त करने के लिए, एक बहु-स्ट्रैटेगी सहयोगी योजना को अपनाया गया था। सबसे पहले, यह ऑटोफॉस्फोराइलेशन की विषमता को खत्म करने के लिए एस्चेरिचिया कोलाई में λ -phosphatase के साथ सह -व्यक्त किया गया था। यद्यपि उपज कम हो गई थी, पूर्ण डीफॉस्फोराइलेशन सुनिश्चित किया गया था। IMAC द्वारा कब्जा करने के बाद, एकत्रीकरण को रोकने के लिए एलुएंट को स्टेबलाइजर्स (50 मिमी आर्जिनिन, 50 मिमी ग्लूटामिक एसिड और 10 मिमी डीटीटी) के साथ पूरक किया गया था, और उसके टैग को टीईवी पाचन द्वारा हटा दिया गया था। फिर, सही ऑलिगोमर को एसईसी द्वारा अलग किया गया था (5% ग्लिसरॉल और -मे)। अंतिम महत्वपूर्ण आयन एक्सचेंज स्टेप क्रिस्टलीय (गैर-फॉस्फोराइलेटेड) और गैर-क्रिस्टलीय (आंशिक रूप से फॉस्फोराइलेटेड) CLK1 समूहों के बीच अंतर करता है। यह विशेष रूप से ध्यान देने योग्य है कि सेल lysis का मोड प्रोटीन स्थिरता को महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित करता है-उच्च दबाव और उच्च-तापमान विधि CLK1 के अपरिवर्तनीय एकत्रीकरण की ओर ले जाती है, जो किनसे की तैयारी के लिए हल्के उपचार के महत्व को उजागर करती है।

 

 

 

12। स्थिर लिगैंड-बाइंडिंग क्षमता के साथ गैलेक्टिन -1 का उत्पादन करें

लिगैंड बाइंडिंग अध्ययनों के लिए कार्यात्मक गैलेक्टिन -1 तैयार करने के लिए, चार निर्माणों की अभिव्यक्ति और शुद्धि रणनीतियों (अनलेबेल्ड और उनके-लेबल्ड वाइल्ड-टाइप गैलेक्टिन -1, अनलेबेल्ड और उनके-लेबल्ड सिस्टीन-फ्री म्यूटेंट गैलेक्टिन}}) की तुलना की गई थी। प्रमुख निष्कर्षों से संकेत मिलता है कि लैक्टोज आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी शोधन प्रभावी रूप से सही ढंग से मुड़े हुए प्रोटीन के लिए स्क्रीन कर सकता है, लेकिन बाइंडिंग साइट से लैक्टोज को पूरी तरह से हटाने और सीआरडी गतिविधि को पुनर्स्थापित करने के लिए इसे पूरी तरह से डायलिसिस (HEPES बफर) के साथ जोड़ा जाना चाहिए। जंगली-प्रकार गैलेक्टिन -1 ऑक्सीकरण और निष्क्रियता के लिए प्रवण है, और इसकी स्थिरता एजेंटों को कम करने की उपस्थिति में भी सीमित रहती है (चित्रा 6)। हालांकि, सिस्टीन-मुक्त उत्परिवर्ती डिसल्फाइड बॉन्ड निर्भरता को समाप्त करके तुलनीय एग्लूटिनेशन गतिविधि और थर्मल स्थिरता (नैनोड्सफ, आईटीसी, आदि द्वारा सत्यापित) को बनाए रखते हुए दीर्घकालिक स्थिरता को बढ़ाता है।

चित्रा 6। पुनः संयोजक गैलेक्टिन -1 के हाइड्रोडायनामिक लक्षण वर्णन से इसकी अस्थिरता का पता चलता है

 

13। एंडोटॉक्सिन निष्कासन

एंडोटॉक्सिन हटाने की विधि सकारात्मक रूप से चार्ज किए गए क्रोमैटोग्राफी (आयन एक्सचेंज), पॉलीकेशनिक लिगेंड्स (जैसे पॉली-एल-लिसीन (पीएलएल), इमोबिलाइज्ड पॉलीमाइन (पॉलीमाइक्सिन बी)) और सर्फैक्टेंट ट्रिटन एक्स {2} के अलावा शामिल है। शुद्धि प्रक्रिया के दौरान, एलपीएस-मुक्त पानी के साथ बफर समाधान तैयार करने पर ध्यान दें, और नए कॉलम या कॉलम का उपयोग करें जो केवल अन्य एलपीएस-मुक्त शुद्धिकरण में उपयोग किए गए हैं। एंडोटॉक्सिन संदूषण के लिए, क्रोमैटोग्राफिक पंप/द्रव प्रणाली को 0 में रातोंरात ऊष्मायन किया जा सकता है। नमूने में एलपीएस की अंतिम मात्रा का मूल्यांकन लिमुलस एमेबोसाइट लिसेट अभिकर्मक (एलएएल) का उपयोग करके किया गया था, और यह सत्यापित किया गया था कि क्या यह विशिष्ट अनुप्रयोग के लिए आवश्यक सीमा से नीचे था।

 

14। प्रोटीन कॉम्प्लेक्स

प्रोटीन परिसरों की अभिव्यक्ति और शुद्धि को विशिष्ट स्थितियों के अनुसार अनुकूलित करने की आवश्यकता है। चुनौतियों में सबयूनिट्स की अस्थिरता या मिसफोल्डिंग शामिल हैं। प्रत्येक सबयूनिट को स्वतंत्र रूप से व्यक्त किया जा सकता है और इन विट्रो में इकट्ठा किया जा सकता है, या कार्यात्मक प्रोटीन कॉम्प्लेक्स बनाने के लिए सह-व्यक्त किया जा सकता है। निर्माण डिजाइन को विधानसभा के साथ हस्तक्षेप करने से बचने के लिए शुद्धिकरण या डिटेक्शन लेबल के साथ सावधानीपूर्वक पेश किया जाना चाहिए, खासकर जब जटिल जानकारी सीमित हो और कई अनुकूलन की आवश्यकता होती है। शुद्धि प्रक्रिया के दौरान, जटिल की अखंडता और स्थिरता का मूल्यांकन करने की आवश्यकता है। तरीकों में एसडीएस-पेज (सबयूनिट डिटेक्शन), सेक (समरूपता), सेक-माल (दाढ़ द्रव्यमान विश्लेषण), द्रव्यमान फोटोमेट्री या प्राकृतिक द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री (द्रव्यमान सत्यापन) शामिल हैं। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि परिसर कम सांद्रता में अलग हो सकता है। इस समय, क्रोमैटोग्राफिक विधि या बफर (जैसे कि थर्मल ड्रिफ्ट या डीएसएफ स्क्रीनिंग की स्थिति के माध्यम से) को अनुकूलित करने की आवश्यकता है। इसके अलावा, शुद्धिकरण चरणों को कम करने से कमजोर बातचीत सबयूनिट्स के नुकसान को रोका जा सकता है और शुद्धि दक्षता और परिसर की अखंडता को संतुलित किया जा सकता है।

 

 

 

15। एंटीजन-एंटीबॉडी परिसरों की शुद्धि

एंटीबॉडी-एंटीजेन कॉम्प्लेक्स प्रोटीन कॉम्प्लेक्स के विशिष्ट उदाहरण हैं। उनका सह-क्रिस्टलीकरण बाध्यकारी पैटर्न को प्रकट कर सकता है और एंटीबॉडी इंजीनियरिंग के अनुकूलन का मार्गदर्शन कर सकता है। पारंपरिक तरीकों को एंटीजन और एंटीबॉडी की अलग शुद्धि की आवश्यकता होती है और फिर उन्हें मिलाया जाता है। हालांकि, हाल के अध्ययनों से पता चला है कि सह-अभिव्यक्ति और सह-शुद्धिकरण रणनीतियाँ अधिक कुशल हैं। जटिल को प्राप्त करने के लिए केवल एक शुद्धिकरण की आवश्यकता होती है, और एक ही समय में, अस्थिर एंटीजन को एंटीबॉडी के माध्यम से स्थिर किया जा सकता है, और यहां तक ​​कि लेबल-मुक्त अभिव्यक्ति भी प्राप्त की जा सकती है। इस विशिष्ट स्थिति में, एसडीएस-पेज और जेल निस्पंदन (एसईसी) आमतौर पर परिसर की शुद्धता और गुणवत्ता का मूल्यांकन करने के लिए पर्याप्त होते हैं।

 

सारांश

प्रोटीन शुद्धि वैज्ञानिक अनुसंधान में एक मौलिक तकनीक है। शैक्षणिक-पैमाने पर प्रोटीन उत्पादन आमतौर पर मानक रणनीतियों का अनुसरण करता है और मिलिग्राम-स्तरीय उच्च-शुद्धता, घुलनशील प्रोटीन का उत्पादन कर सकता है, जो व्यापक रूप से संरचनात्मक जीव विज्ञान, जैव रसायन और कार्यात्मक अनुसंधान में उपयोग किए जाते हैं। हालांकि, डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों की विशेष आवश्यकताओं (जैसे कि पशु प्रयोगों में कोई एंडोटॉक्सिन की आवश्यकता और न्यूक्लिक एसिड अनुसंधान में कोई न्यूक्लियस संदूषण नहीं) या प्रोटीन की अंतर्निहित विशेषताओं (जैसे कि आसान एकत्रीकरण, डिसल्फाइड बॉन्ड या उच्च न्यूक्लिक एसिड आत्मीयता से युक्त) अक्सर अनुकूलित समाधान की आवश्यकता होती है। यह समीक्षा, इन विशेष परिस्थितियों के जवाब में, अभिव्यक्ति प्रणालियों के चयन, निर्माणों के डिजाइन (लेबल और डोमेन सीमाओं का अनुकूलन) के चयन से लेकर शुद्धिकरण प्रक्रिया तक परिष्कृत रणनीतियों का प्रस्ताव करती है, और महत्वपूर्ण चरणों में गुणवत्ता नियंत्रण (जैसे कि एसईसी, एसडीएस-पृष्ठ, गतिविधि का पता लगाने, आदि) का परिचय देती है। कुछ अनुप्रयोगों को अतिरिक्त विश्लेषण (जैसे एंडोटॉक्सिन डिटेक्शन और न्यूक्लिक एसिड अवशेष निर्धारण), बायोफार्मास्यूटिकल उद्योग में "गुणवत्ता आश्वासन" (क्यूए) अवधारणा के समान, जैसे कि व्यवस्थित प्रक्रियाओं के माध्यम से दोषों को रोकने के लिए, "गुणवत्ता आश्वासन" (क्यूए) की अवधारणा की भी आवश्यकता होती है। गुणवत्ता नियंत्रण दिशानिर्देशों को तैयार करने और वैज्ञानिक अनुसंधान में उपयोग किए जाने वाले प्रोटीन अभिकर्मकों के लिए विशिष्ट मानकों को स्पष्ट करने से, इसका उद्देश्य शैक्षणिक प्रयोगशालाओं के लिए अधिक कठोर प्रोटीन शुद्धि मानदंडों को स्थापित करना है, प्रायोगिक डेटा की विश्वसनीयता और पुनरावृत्ति को बढ़ाना है, और बुनियादी अनुसंधान और औद्योगिक मानकों के बीच अंतर को पाटते हैं।

 

Doi: 10.1186/s 12934-022-01778-5