उपयुक्त अल्ट्राफिल्ट्रेशन ट्यूब कैसे चुनें?

आमतौर पर प्रोटीन सांद्रता और बफर प्रतिस्थापन के लिए उपयोग की जाने वाली अल्ट्राफिल्ट्रेशन ट्यूबों का उपयोग अक्सर अल्ट्राफिल्ट्रेशन ट्यूबों में किया जाता है। लक्ष्य प्रोटीन के आणविक भार, एकाग्रता से पहले की मात्रा और एकाग्रता की लक्ष्य मात्रा के आधार पर, अन्य मॉडल हैं, जिनमें अलग-अलग वॉल्यूम आकार और अल्ट्राफिल्ट्रेशन ट्यूब हैं। पुन: प्रयोज्य।

1. एक उपयुक्त अल्ट्राफिल्ट्रेशन ट्यूब का चयन करें, मुख्य रूप से MWCO और एकाग्रता मात्रा को ध्यान में रखते हुए। आम तौर पर, आणविक भार लक्ष्य प्रोटीन के आणविक भार के 1/3 से अधिक नहीं होना चाहिए। यदि लक्ष्य प्रोटीन का आणविक भार लगभग 10 kd है, तो 3 KD के प्रतिधारित आणविक भार वाली एक अल्ट्राफिल्ट्रेशन ट्यूब का उपयोग किया जा सकता है।

2. नया खरीदा गया अल्ट्राफिल्ट्रेशन सूखा है। उपयोग करने से पहले मिलिक पानी डालें। पानी पूरी तरह से झिल्ली से होकर गुजरता है और कुछ मिनटों के लिए बर्फ के स्नान या रेफ्रिजरेटर में पहले से ठंडा हो जाता है। फिर प्रोटीन घोल डालने के लिए पानी डालें। प्रोटीन विलयन की मात्रा परखनली के शीर्ष पर सफेद रेखा से अधिक नहीं होनी चाहिए। आसान कामकाज। प्रोटीन समाधान जोड़ने से पहले, अल्ट्राफिल्ट्रेशन ट्यूब को पूर्व शीतलन के लिए बर्फ में डालने की आवश्यकता होती है।

3. संतुलन। गुरुत्वाकर्षण का द्रव्यमान और केंद्र संतुलित होना चाहिए। ध्यान दें कि गति और त्वरण बहुत तेज नहीं होना चाहिए, अन्यथा अल्ट्राफिल्ट्रेशन झिल्ली सीधे क्षतिग्रस्त हो जाएगी। केन्द्रापसारक अल्ट्राफिल्ट्रेशन शुरू करें (सेंट्रीफ्यूज को 4 डिग्री तक ठंडा करना)। डायाफ्राम और घूर्णन शाफ्ट की दिशा निर्देशों के अनुसार समायोजित की जा सकती है (कोण अपकेंद्रित्र के मामले में, डायाफ्राम शाफ्ट के लंबवत है)। वास्तविक उपयोग में, सामान्य गति मैनुअल में निर्दिष्ट की तुलना में कम है, जो केन्द्रापसारक पाइप के सेवा जीवन को लम्बा खींच सकती है।

4. जब शेष 1ml पर केंद्रित हो, [50ul घरेलू ब्रैडफोर्ड समाधान लें, यह देखने के लिए कि क्या यह नीला हो जाता है, 10ul द्रव जोड़ें, और निर्धारित करें कि क्या अल्ट्राफिल्ट्रेशन ट्यूब प्रोटीन को लीक करती है। यदि ट्यूब लीक हो जाती है, तो इसे ऊपरी परत में डालें और फिर अल्ट्राफिल्ट्रेशन शुरू करने के लिए वापस नई ट्यूब में प्रवाहित करें। सटीक रूप से यह निर्धारित करने के लिए कि क्या टेस्ट ट्यूब लीक है, कृपया 5mg 10min सेंट्रीफ्यूज 10min करें, फिर इसे पास करें, प्रोटीन जेल या ब्रैडफोर्ड चलाएं] [मोटे माप]। ध्यान केंद्रित करने के लिए शेष प्रोटीन समाधान जोड़ना जारी रखें (प्रोटीन हीटिंग को रोकने के लिए बर्फ पर काम करें) जब तक कि सभी केंद्रित समाधान नहीं जोड़े जाते। सेंट्रीफ्यूजेशन के दौरान, ध्यान दें कि क्या प्रोटीन वर्षा होती है और ट्यूब ब्लॉकेज का कारण बनती है। यदि वर्षा होती है, तो कृपया वर्षा का विशिष्ट कारण निर्धारित करें, चाहे प्रोटीन की सांद्रता बहुत अधिक हो या बफर अनुपयुक्त हो; पूर्व को एकाग्रता को कम करने के लिए एक ही समय में कई अल्ट्राफिल्ट्रेशन ट्यूबों का उपयोग करके हल किया जा सकता है, जबकि बाद वाले प्रोटीन के अवक्षेपित होने तक विभिन्न बफ़र्स को बदल सकते हैं।

5. पिछले चरणों का उपयोग प्रोटीन को केंद्रित करने के लिए किया जाता है। यदि बफर को प्रतिस्थापित किया जाना है, जब कुल प्रोटीन समाधान लगभग 1ml तक केंद्रित होता है, तो धीरे से एक नया बफर जोड़ें (0.22um अल्ट्राफिल्ट्रेशन झिल्ली के माध्यम से अल्ट्राफिल्ट्रेशन), और फिर तीन बार के लिए लगभग 1ml पर लगातार ध्यान केंद्रित करें, इसलिए कि अंतिम सांद्रता आवश्यक प्रोटीन सांद्रता पर निर्भर करती है, जो आमतौर पर 500ul से अधिक या 200ul से कम नहीं होती है। हर बार कम से कम 10 गुना की मात्रा के अनुसार, यह तीन गुना के 1000 गुना से अधिक है, जो मूल रूप से बफर को बदलने के उद्देश्य को प्राप्त कर सकता है।

6. अंतिम प्रोटीन ध्यान हटा दें। बर्फ पर काम करें। एक पीले पिपेट टिप (200ul) का उपयोग करके, धीरे से किनारे के साथ पिपेट टिप डालें, फिर धीरे से उड़ाएं और प्रोटीन समाधान मिलाएं। सावधान रहें कि अल्ट्राफिल्ट्रेशन झिल्ली को न छुएं। सांद्र विलयन को हर बार 200ul तक चूसें जब तक कि यह पूरी तरह से चूसा न जाए। टेस्ट ट्यूब के तल पर अंतिम केंद्रित समाधान निकालना आवश्यक नहीं है, अन्यथा यह बहुत मुश्किल है और अल्ट्राफिल्ट्रेशन झिल्ली क्षतिग्रस्त हो सकती है। अंत में, पानी के नुकसान और झिल्ली के सूखने को रोकने के लिए अल्ट्राफिल्ट्रेशन झिल्ली से गुजरे बिना मिलीक पानी को अल्ट्राफिल्ट्रेशन ट्यूब में जोड़ा जाता है।

7. अल्ट्राफिल्ट्रेशन ट्यूब के उपचार और अल्ट्राफिल्ट्रेशन ट्यूब के पुन: उपयोग के लिए निम्नलिखित चरण हैं।

8. अल्ट्राफिल्ट्रेशन ट्यूब में पानी डालें और धीरे से मिलिक पानी से कई बार कुल्ला करें। [यदि परखनली के तल पर स्पष्ट प्रोटीन अवक्षेपण है, तो आप पहले पानी मिला सकते हैं और फिर इसे पिपेट से उड़ा सकते हैं। सावधान रहें कि झिल्ली को न छुएं। तलछट नीचे लटकती है और फिर भाग जाती है। आप इसे नल के पानी से नहीं बहा सकते। 0.2m NaOH विलयन मिलाने के बाद, इसे 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर रखें, और इस अवधि के दौरान अल्ट्राफिल्ट्रेशन ट्यूब को संतुलित करें। एक और 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र। शेष NaOH के घोल को डालें और कॉटन कोर को बीकर (1 या 2L) मिलिक पानी में डुबोएं, कई घंटों के लिए रखा जाए, और फिर NaOH की सांद्रता को लगातार पतला करने के लिए कई घंटों के लिए रखे गए नए पानी से बदल दिया जाए। 50 मिली परखनली को धोकर नल के पानी से ढक दें, और भीतरी दीवार को मिलीक पानी से धो लें।

9. डूबे हुए टेस्ट ट्यूब कोर को बाहर निकालें, इसे पूरे मिलिक पानी में डालें, और फिर 50 मिली टेस्ट ट्यूब को मिलिक पानी से भरें। धीरे-धीरे ट्यूब कोर को 50ml में डालें।

अपकेंद्रित्र ट्यूब, नाली और पानी विभाजित करें, फिर कवर करें और अगले उपयोग तक 4 डिग्री पर स्टोर करें। सामान्यतया, उपरोक्त चरणों और सावधानियों के अनुसार, प्रत्येक ट्यूब तीन या चार साल के भीतर नहीं टूटेगी।