प्राकृतिक कोलेजन निष्कर्षण में अल्ट्राफिल्ट्रेशन का अनुप्रयोग

कोलेजन, एक प्राकृतिक प्रोटीन संसाधन के रूप में, अच्छी जैव-अनुकूलता, कम प्रतिजनता, जैव-निम्नीकरणशीलता और हेमोस्टेसिस, इसकी तंग पेचदार संरचना और इसकी अपनी विशेषताएं हैं, जो सभी इसके औद्योगीकरण के लिए आवश्यक शर्तें प्रदान करती हैं। कोलेजन और इसके उप-उत्पादों का उपयोग न केवल पैकेजिंग सामग्री, सौंदर्य प्रसाधन और स्वास्थ्य देखभाल उत्पादों के रूप में किया जाता है, बल्कि मांस उत्पाद को बेहतर बनाने के लिए खाद्य योजक के रूप में भी किया जाता है, और यह विशेष रूप से चिकित्सा क्षेत्र में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है।

 

कोलेजन क्या है?

 

कोलेजन एक जैविक मैक्रोमोलेक्यूल है, जो जानवरों के संयोजी ऊतक का मुख्य घटक है, और स्तनधारियों में सबसे प्रचुर और व्यापक रूप से वितरित कार्यात्मक प्रोटीन है, जो कुल प्रोटीन का 25% से 30% और यहां तक ​​कि कुछ जीवों में 80% या उससे अधिक तक होता है। यह जंतु कोशिकाओं में ऊतक को जोड़ने की भूमिका निभाता है।

यह मापा जाता है कि एक वयस्क के शरीर में लगभग 3 किलोग्राम कोलेजन होता है, जो मुख्य रूप से मानव त्वचा, हड्डियों, आंखों, दांतों, टेंडन, आंतरिक अंगों (हृदय, पेट, आंतों, रक्त वाहिकाओं सहित) और मानव शरीर के अन्य भागों में मौजूद होता है। इसका कार्य त्वचा और ऊतकों और अंगों की आकृति विज्ञान और संरचना को बनाए रखना है, और यह चोट के बाद विभिन्न ऊतकों की मरम्मत के लिए एक महत्वपूर्ण कच्चा माल भी है।

 

कोलेजन प्रोटीन कई प्रकार के होते हैं, और सामान्य प्रकार प्रकार I, प्रकार II, प्रकार III, प्रकार V और XI हैं। अपनी अच्छी बायोकम्पैटिबिलिटी, बायोडिग्रेडेबिलिटी और बायोएक्टिविटी के कारण, कोलेजन का भोजन, चिकित्सा, ऊतक इंजीनियरिंग, सौंदर्य प्रसाधन और अन्य क्षेत्रों में व्यापक रूप से उपयोग किया गया है।

प्राकृतिक कोलेजन कैसे निकालें

पशुधन और कुक्कुट से प्राप्त पशु ऊतक लोगों के लिए प्राकृतिक कोलेजन और इसके कोलेजन पेप्टाइड्स प्राप्त करने का मुख्य तरीका है। हालाँकि, संबंधित पशु रोगों और कुछ धार्मिक मान्यताओं के कारण, लोगों द्वारा भूमि स्तनधारियों से प्राप्त कोलेजन और इसके उत्पादों का उपयोग सीमित है, और विकास धीरे-धीरे समुद्री जीवों की ओर बढ़ रहा है। यूरोपीय खाद्य सुरक्षा प्राधिकरण (ईएफएसए) ने पुष्टि की है कि जानवरों की हड्डियों से प्राप्त कोलेजन में भी पागल गाय रोग और अन्य संबंधित बीमारियों को संक्रमित करने की क्षमता नहीं है। अमीनो एसिड संरचना और क्रॉसलिंकिंग डिग्री में अंतर के कारण, जलीय जानवरों, विशेष रूप से त्वचा, हड्डी और स्केल जैसे उनके प्रसंस्करण अपशिष्टों में समृद्ध कोलेजन के कई फायदे हैं जो पशुधन कोलेजन के पास नहीं हैं। इसके अलावा, समुद्री जानवरों से प्राप्त कोलेजन कुछ पहलुओं में स्पष्ट रूप से भूमि जानवरों से प्राप्त कोलेजन से बेहतर है, जैसे कि कम एंटीजेनेसिटी और हाइपोएलर्जेनिकिटी। इसलिए, जलीय कोलेजन धीरे-धीरे स्थलीय पशु कोलेजन की जगह ले सकता है। ग्रास कार्प मछली के स्केल से कोलेजन निकालने की प्रक्रिया को एक उदाहरण के रूप में लिया गया था।

 

अल्ट्राफिल्ट्रेशन विधि द्वारा ग्रास कार्प मछली के शल्क से कोलेजन का निष्कर्षण

1. सामग्री और विधियाँ

1.1 परीक्षण नमूना

अपरिष्कृत कोलेजन जलीय अर्क।

1.2 परीक्षण विधियाँ

1.2.1 अल्ट्राफिल्ट्रेशन प्रक्रिया मार्ग

 

1.2.2 पूर्व निस्पंदन प्रक्रिया निर्धारण

इस परीक्षण में, सर्वोत्तम पूर्व-निस्पंदन निस्पंदन प्रक्रिया निर्धारित करने के लिए वैक्यूम निस्पंदन विधि और माइक्रोफिल्ट्रेशन विधि की तुलना और विश्लेषण किया जाता है। विशिष्ट परीक्षण विधियाँ इस प्रकार हैं:

① पानी के अर्क में निलंबित कणों और अशुद्धियों को हटाने के लिए कच्चे कोलेजन पानी के अर्क को फिल्टर पेपर के वैक्यूम पंपिंग द्वारा फ़िल्टर किया गया था।

② पानी के अर्क में अघुलनशील पदार्थ और अशुद्धियों को हटाने के लिए कच्चे कोलेजन पानी के अर्क को 0.2μm माइक्रोफिल्ट्रेशन झिल्ली द्वारा फ़िल्टर किया गया था।

 

1.2.3 अल्ट्राफिल्ट्रेशन झिल्ली छिद्र आकार का चयन

अल्ट्राफिल्ट्रेशन झिल्ली का छिद्र आकार 100 kDa था।

 

1.2.4 अल्ट्राफिल्ट्रेशन शुद्धिकरण प्रक्रिया का एकल कारक प्रयोग

कच्चे कोलेजन जल अर्क को शुद्ध करने के लिए अल्ट्राफिल्ट्रेशन तकनीक का उपयोग किया गया था, और कोलेजन प्रतिधारण पर ऑपरेटिंग दबाव, ऑपरेटिंग तापमान और पीएच मान के प्रभावों पर एकल-कारक प्रयोगों का अध्ययन किया गया था। अल्ट्राफिल्ट्रेशन उपकरण को कुछ समय के लिए शुरू करने और स्थिर करने के बाद, कोलेजन प्रतिधारण पर विभिन्न कारकों के प्रभाव का अध्ययन किया गया।

 

1.2.5 गणना सूत्र

 

2. परिणाम और विश्लेषण

2.1 पूर्व-निस्पंदन प्रक्रिया के विश्लेषण परिणाम

वैक्यूम निष्कर्षण और माइक्रोफिल्ट्रेशन की दो निस्पंदन विधियों के तुलनात्मक परिणाम निम्नलिखित तालिका में दिखाए गए हैं।

 

तालिका से देखा जा सकता है कि वैक्यूम निस्पंदन विधि और माइक्रोफिल्ट्रेशन विधि दोनों घोल में अशुद्धियों और अघुलनशील ठोस पदार्थों को हटा सकती हैं, लेकिन माइक्रोफिल्ट्रेशन विधि का प्रोटीन पर बेहतर सुरक्षात्मक प्रभाव पड़ता है, यानी नुकसान स्पष्ट नहीं होता है, और वैक्यूम निस्पंदन विधि है प्रोटीन की हानि का कारण बनना आसान है। इसके अलावा, वैक्यूम निस्पंदन विधि में कुछ समय के लिए निस्पंदन रखे जाने के बाद मैलापन दिखाई देता है, और माइक्रोफिल्टरेट अभी भी स्पष्ट और पारदर्शी है, इसलिए माइक्रोफिल्ट्रेशन को अल्ट्राफिल्ट्रेशन की पूर्व-उपचार प्रक्रिया के रूप में चुना जाता है।

 

2.2 अल्ट्राफिल्ट्रेशन प्रक्रिया का एकल कारक परीक्षण

2.2.1 अवधारण दर पर अल्ट्राफिल्ट्रेशन दबाव का प्रभाव

तापमान 40 डिग्री और pH=9.0 की स्थिति के तहत, विभिन्न अल्ट्राफिल्ट्रेशन दबावों का प्रभाव (0.07MPa, {{9} }.09एमपीए, 0.11एमपीए, 0.13एमपीए और 0.15एमपीए) प्रोटीन प्रतिधारण पर अध्ययन किया गया। परिणाम नीचे दिए गए चित्र में दिखाए गए हैं।

जैसा कि ऊपर दिए गए आंकड़े से देखा जा सकता है, ऑपरेटिंग दबाव बढ़ने के साथ, प्रोटीन प्रतिधारण दर धीरे-धीरे कम हो जाती है। जब ऑपरेटिंग दबाव {{0}}.07एमपीए होता है, तो प्रोटीन प्रतिधारण दर 96.53% होती है, और जब ऑपरेटिंग दबाव 0.15एमपीए होता है, तो प्रोटीन प्रतिधारण दर 84.38% होती है। ऐसा इसलिए है क्योंकि पदार्थों पर अल्ट्राफिल्ट्रेशन का पृथक्करण प्रभाव दबाव अंतर द्वारा किया जाता है। कम ऑपरेटिंग दबाव की सीमा में, छोटे अणु जल्दी से झिल्ली से गुजर सकते हैं, जबकि बड़े अणु अल्ट्राफिल्ट्रेशन झिल्ली द्वारा फंस सकते हैं और झिल्ली की सतह पर जमा हो सकते हैं। इस समय, झिल्ली की सतह और पानी के अर्क में सांद्रण अंतर होता है, जिसके परिणामस्वरूप सांद्रण ध्रुवीकरण प्रतिरोध होता है। इस समय, दबाव अपेक्षाकृत कम है, और अवधारण दर पर बहुत अधिक प्रभाव नहीं पड़ सकता है। हालाँकि, दबाव बढ़ने के साथ, एकाग्रता ध्रुवीकरण प्रतिरोध धीरे-धीरे बढ़ता है, और झिल्ली की सतह और पानी के अर्क के बीच एकाग्रता का अंतर संतुलन तक पहुँच जाता है। जब दबाव इस संतुलन से अधिक हो जाता है, तो झिल्ली की सतह पर एक जेल परत बन सकती है (जो इस सिद्धांत के अनुरूप है कि अल्ट्राफिल्ट्रेशन के दौरान एकाग्रता ध्रुवीकरण और संघनन परत बनती है), और दबाव बढ़ता रहता है, जेल परत की मोटाई बढ़ जाती है , और झिल्ली की सतह पर शेष प्रोटीन भी बढ़ जाता है। इसके परिणामस्वरूप प्रतिधारण दर कम होती है. झिल्ली के पृथक्करण प्रभाव को सुनिश्चित करने के लिए, ऑपरेटिंग दबाव का इष्टतम पैरामीटर 0.07MPa है।

 

2.2.2 प्रोटीन प्रतिधारण पर तापमान का प्रभाव

{0}}.11एमपीए दबाव और पीएच=9.0 की स्थितियों के तहत, प्रोटीन पर विभिन्न तापमानों, अर्थात् 25 डिग्री, 30 डिग्री, 35 डिग्री, 40 डिग्री और 45 डिग्री का प्रभाव पड़ता है। प्रतिधारण का अध्ययन किया गया। परिणाम नीचे दिए गए चित्र में दिखाए गए हैं।

जैसा कि ऊपर दिए गए चित्र से देखा जा सकता है, तापमान बढ़ने के साथ अल्ट्राफिल्ट्रेशन झिल्ली की अवधारण दर धीरे-धीरे बढ़ती है, और 97.01% की अवधारण दर के साथ 45 डिग्री पर अधिकतम तक पहुंच जाती है। ऐसा इसलिए है क्योंकि कोलेजन की चिपचिपाहट का तापमान से गहरा संबंध है। जब तापमान कम होता है, तो कोलेजन की चिपचिपाहट अधिक होती है, और झिल्ली की सतह पर कोलेजन के संचय से प्रतिरोध बनाना आसान होता है, जिसके परिणामस्वरूप कम अवधारण दर होती है। जब तापमान बढ़ता है, तो कोलेजन की चिपचिपाहट कम हो जाती है, कोलेजन अणुओं के बीच परस्पर क्रिया कमजोर हो जाती है, और द्रव्यमान स्थानांतरण दर बढ़ जाती है, एकाग्रता ध्रुवीकरण घटना कमजोर हो जाती है, और अवधारण दर बढ़ जाती है। अवधारण दर में वृद्धि का एक अन्य कारण यह है कि तापमान बढ़ता है, कोलेजन की घुलनशीलता भी तदनुसार बढ़ जाती है, और झिल्ली को अवरुद्ध करने वाले कोलेजन की घटना कम हो जाती है, इसलिए अल्ट्राफिल्ट्रेशन का इष्टतम तापमान 45 डिग्री है।

 

2.2.3 प्रोटीन प्रतिधारण पर पीएच मान का प्रभाव

{0}}.11एमपीए दबाव और 40 डिग्री तापमान की स्थितियों के तहत, विभिन्न पीएच स्थितियों का प्रभाव, अर्थात् पीएच=6.0, पीएच{{ 5}}.{{10}}, pH=8.0, pH=9.0 और pH=10.0, अवधारण दर पर अध्ययन किया गया। परिणाम नीचे दिए गए चित्र में दिखाए गए हैं।

 

As can be seen from the figure above, in the range of pH 6-7, the protein retention rate decreases with the increase of pH value, and the minimum value is 82.13% when pH=7.0; when pH>7, the retention rate gradually increases with the increase of pH value. This is because the isoelectric point of collagen is pH=7. At the isoelectric point, the protein is in a state of precipitation, which is easy to stay on the surface of the membrane and block the membrane, thus reducing the retention rate. When pH>7, पीएच मान में वृद्धि के साथ अवधारण दर धीरे-धीरे बढ़ती है। ऐसा इसलिए है क्योंकि अल्ट्राफिल्ट्रेशन झिल्ली नकारात्मक चार्ज के साथ पॉलीथर मेपल झिल्ली है, और कोलेजन क्षारीय परिस्थितियों में नकारात्मक रूप से चार्ज होता है। नकारात्मक रूप से चार्ज किए गए कोलेजन अणु समान चार्ज के साथ अल्ट्राफिल्ट्रेशन झिल्ली के साथ एक परस्पर अनन्य स्थिति बनाते हैं, इस प्रकार कोलेजन अणुओं के लिए झिल्ली की सतह पर रहना और झिल्ली को अवरुद्ध करना आसान नहीं होता है। इसलिए, अल्ट्राफिल्ट्रेशन का इष्टतम पीएच मान 8-10 है।

 

2.3 अल्ट्राफिल्ट्रेशन प्रक्रिया अनुकूलन और परिणाम सत्यापन

डिज़ाइन-एक्सपर्ट8.05 सॉफ़्टवेयर के विश्लेषण के अनुसार, इष्टतम प्रक्रिया पैरामीटर हैं: ऑपरेटिंग दबाव 0.14MPa, ऑपरेटिंग तापमान 40.98 डिग्री, समाधान pH{{7 }}.43, और अवधारण दर 92.551% है। वास्तविक मापदंडों की संचालन क्षमता को ध्यान में रखते हुए, अल्ट्राफिल्ट्रेशन स्थितियों को 0.14MPa ऑपरेटिंग दबाव, 40 डिग्री ऑपरेटिंग तापमान और सामग्री समाधान के 9.50 pH मान के रूप में चुना गया था, और अल्ट्राफिल्ट्रेशन सिस्टम शुरू होने और स्थिर होने के बाद परीक्षण सत्यापन शुरू किया गया था। अवधारण दर का परिणाम (92.61±0.1) % (n=3) था। समीकरण के अनुमानित मूल्य मूल रूप से मापा मूल्यों के समान हैं, जो दर्शाता है कि अनुमानित स्थिति पैरामीटर परिणाम वास्तविक स्थिति परिणामों के अनुरूप हैं।

 

2.4 इलेक्ट्रोफोरेटिक विश्लेषण परिणाम

शुद्ध कोलेजन का विश्लेषण एसडीएस-पेज इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा किया गया था, और परिणाम निम्नलिखित आंकड़े में दिखाए गए थे।

 

जैसा कि ऊपर दिए गए चित्र से देखा जा सकता है, लेन 1 इस परीक्षण का शुद्ध कोलेजन है, और लेन 2 बछड़ा कण्डरा का मानक कोलेजन नमूना है। एसडीएस-पेज इलेक्ट्रोफोरेसिस से यह देखा जा सकता है कि इस अध्ययन में कोलेजन को कोलेजन के रूप में पहचाना जा सकता है, लेकिन ए1 पेप्टाइड श्रृंखला और ए2 पेप्टाइड श्रृंखला के बीच की सीमाएं स्पष्ट नहीं लगती हैं। इलेक्ट्रोफोरेटिक मानचित्र से यह देखा जा सकता है कि कोई अन्य प्रोटीन अशुद्धता नहीं है, इसलिए यह निष्कर्ष निकाला जा सकता है कि शुद्ध कोलेजन में शुद्धता अधिक है।

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