समावेशन बोड शुद्धिकरण में खोखले फाइबर के कई अनूठे तरीकों की संक्षिप्त चर्चा

समावेशन निकाय (आईबी) उच्च घनत्व वाले, अघुलनशील प्रोटीन कण होते हैं जो झिल्लियों में लिपटे होते हैं, जो तब बनते हैं जब विदेशी जीन प्रोकैरियोटिक कोशिकाओं में व्यक्त होते हैं, खासकर एस्चेरिचिया कोलाई में। जब माइक्रोस्कोप के नीचे देखा जाता है, तो आईबी एक उच्च-अपवर्तन क्षेत्र है, जो स्पष्ट रूप से साइटोप्लाज्म के अन्य घटकों से अलग है।

समावेशन शरीर का गठन अपेक्षाकृत जटिल है, जो साइटोप्लाज्म में प्रोटीन उत्पादन की दर से संबंधित है, नव निर्मित पेप्टाइड्स की सांद्रता अधिक है, और फोल्ड करने के लिए पर्याप्त समय नहीं है, ताकि अनाकार प्रोटीन समुच्चय बन सकें। समावेशन निकाय मूल रूप से प्रोटीन से बने होते हैं, जिनमें से 5 से अधिक 2% क्लोन उत्पाद होते हैं। इन उत्पादों की प्राथमिक संरचना पूरी तरह से सही है, लेकिन त्रि-आयामी विन्यास गलत है, इसलिए कोई जैविक गतिविधि नहीं है। समावेशन निकाय का आकार 0.5-1μm है, जो पानी में अघुलनशील है, केवल यूरिया, गुआनिडाइन हाइड्रोक्लोराइड आदि जैसे विकृत पदार्थों में घुलनशील है।

ई. कोलाई में, समावेशन निकाय कोशिका के दो स्थानों में हो सकते हैं: साइटोप्लाज्म और परिधीय साइटोप्लाज्म। कोशिका में समावेशन निकायों का स्थान और विशेषताएं इस बात पर निर्भर करती हैं कि प्रोटीन कैसे व्यक्त किया जाता है।

ई. कोली के साइटोप्लाज्म में समावेशन आम तौर पर व्यास में {{0}}.2 से 1.5μm तक होता है, और विभिन्न प्रोटीनों में अलग-अलग व्यास होते हैं, जैसे कि इंटरफेरॉन का आकार 0.811μm है, और का आकार प्रोरेनेट 1.281μm है। कुछ मामलों में, कुछ समावेशन निकायों का व्यास ई. कोलाई के व्यास से बड़ा होता है, जो ई. कोली को एक उभार देता है। सामान्य तौर पर, एक कोशिका में केवल एक समावेशन निकाय होता है।

 

समावेशन शरीर शुद्धि

 

समावेशन शरीर शुद्धि प्रक्रिया आम तौर पर है:

सेल क्रशिंग:

सेल क्रशिंग की सामान्य तकनीक है: उच्च गति ऊतक क्रशिंग, ग्लास होमोजेनाइज़र होमोजेनाइजेशन, अल्ट्रासोनिक उपचार, बार-बार फ्रीज-पिघलना विधि, रासायनिक उपचार (आमतौर पर लाइसोजाइम उपचार का उपयोग करना)।

 

समावेशन शरीर की धुलाई:

समावेशन निकाय बैक्टीरिया द्वारा व्यक्त प्रोटीन के इंट्रासेल्युलर एग्लूटीनेशन द्वारा निर्मित निष्क्रिय ठोस कण होते हैं, जो आमतौर पर अनाकार, अघुलनशील रूप में मौजूद होते हैं। समावेशन निकाय में, वास्तविक लक्ष्य प्रोटीन केवल लगभग 50% होता है, और बाकी में लिपिड, लिपोपॉलीसेकेराइड, न्यूक्लिक एसिड और हेटरोप्रोटीन होते हैं, जो समावेशन निकाय से बंधे होते हैं और समावेशन निकाय प्रोटीन के पुनर्जीवन को प्रभावित करते हैं। इसलिए, विकृतीकरण से पहले धोना एक बहुत ही आवश्यक कदम है।

इसके अलावा, समावेशन निकायों की धुलाई पुनः संयोजक प्रोटीन की रीफोल्डिंग उपज को बढ़ाने में सहायक होती है। अशुद्धियों को दूर करके, पुनर्विकास प्रक्रिया में बाधाओं को कम किया जा सकता है, ताकि प्रोटीन को अधिक कुशलता से मोड़ा जा सके और सही ढंग से इकट्ठा किया जा सके, जिससे प्रोटीन की गतिविधि और कार्य में सुधार हो सके।

धुलाई में आमतौर पर 1% से कम तटस्थ डिटर्जेंट का उपयोग किया जाता है, जैसे कि ट्वीन, ट्राइटन, यूरिया और एनपी 40 प्लस ईडीटीए और कम करने वाले एजेंट 2-मर्कैप्टोट्रेइटोल (डीटीटी), -मर्कैप्टोएथेनॉल कई बार दोहराया जाता है, क्योंकि डिटर्जेंट धोने की क्षमता बढ़ जाती है समाधान की आयनिक शक्ति में वृद्धि, समावेशन निकायों की धुलाई में आयनिक शक्ति को बढ़ाने के लिए NaCl जोड़ा जा सकता है।

समावेशन निकायों का उपयोग सेंट्रीफ्यूजेशन या निस्पंदन द्वारा सेल ब्रेकडाउन समाधान के अन्य घटकों को हटाने के लिए किया जा सकता है, जो दोनों समावेशन निकायों के विभिन्न भौतिक गुणों का लाभ उठाते हैं।

 

अपकेंद्रित्र:

समावेशन शरीर के प्रोटीन कोशिका के टुकड़ों की समान मात्रा की तुलना में अधिक सघन होते हैं, इसलिए समावेशन शरीर को सेंट्रीफ्यूजेशन के माध्यम से शेष कोशिका से अलग किया जा सकता है। औद्योगिक उत्पादन में समावेशन निकाय प्राप्त करने के लिए निरंतर सेंट्रीफ्यूजेशन सबसे अधिक इस्तेमाल किया जाने वाला ऑपरेशन है। चूँकि कोशिका के टुकड़ों का घनत्व समावेशन निकाय की तुलना में छोटा होता है, अवसादन दर समावेशन निकाय की तुलना में कम होती है। निरंतर निलंबन और सेंट्रीफ्यूजेशन अधिकांश समावेशन निकाय को सेंट्रीफ्यूज कर सकता है, जबकि कोशिका के टुकड़े धीरे-धीरे हटा दिए जाते हैं।
निस्पंदन (स्पर्शरेखा प्रवाह निस्पंदन): समावेशन निकायों और घुलनशील प्रोटीन के विभिन्न आणविक आकारों के कारण, निस्पंदन की विधि का उपयोग किया जा सकता है, जो परिचालन लागत को कम कर सकता है और इसे बढ़ाना आसान बना सकता है। स्पर्शरेखा प्रवाह निस्पंदन (टीएफएफ) ट्रांसमेम्ब्रेन दबाव अंतर से संचालित होता है। झिल्ली छिद्र के आकार से छोटे पदार्थ और अशुद्धियाँ झिल्ली से होकर गुजरती हैं, जबकि बड़े कणों वाली कोशिकाएँ जैसी अशुद्धियाँ फंस जाती हैं। आमतौर पर निस्पंदन धुलाई के लिए उपयोग किया जाने वाला झिल्ली एपर्चर 0.1μm होता है। खोखले फाइबर स्पर्शरेखा प्रवाह माइक्रोफिल्ट्रेशन सीधे तरल सामग्री की उच्च ठोस सामग्री, कम चरणों, सरल ऑपरेशन से निपट सकता है, झिल्ली को मॉड्यूलर स्वचालित उत्पादन की आवश्यकताओं के अनुरूप, सफाई के माध्यम से बार-बार उपयोग किया जा सकता है, उपकरण निवेश और परिचालन लागत को कम किया जा सकता है।

 

गाइडलिंग खोखले फाइबर कॉलम का उपयोग करके शरीर की धुलाई को शामिल करने के लिए निम्नलिखित एक आवेदन मामला है।

हमने 250mL तरल (लक्ष्य प्रोटीन आणविक भार 17kd) को केंद्रित करने के लिए 94cm2 0.1-0.45μm खोखले फाइबर का उपयोग किया। पूरी धुलाई प्रक्रिया में, लक्ष्य प्रोटीन की पुनर्प्राप्ति दर और झिल्ली प्रवाह की कमी की जांच की गई।

{{0}मिनट सांद्रण प्रक्रिया है, 71-224मिनट धुलाई और निस्पंदन प्रक्रिया है। पूरी माइक्रोफिल्ट्रेशन प्रक्रिया के दौरान, टीएमपी धीरे-धीरे बढ़ी, तरल इनलेट गति अपरिवर्तित रही, और औसत सामग्री प्रवाह 12एलएमएच था।

परिणामों से पता चला कि लक्ष्य प्रोटीन पूरी तरह से फंस गया था, और लक्ष्य प्रोटीन की पुनर्प्राप्ति दर 90% से अधिक थी। गाइडलिंग खोखले फाइबर कॉलम इस अनुप्रयोग के लिए स्थिर और उपयुक्त हैं।

 

समावेशन निकाय विघटन:

समावेशन निकाय आम तौर पर विकृतीकरण एजेंट यूरिया या गुआनिडीन हाइड्रोक्लोराइड की स्थिति के तहत विघटित होते हैं, और विघटित समावेशन निकाय प्रोटीन पूरी तरह से विकृतीकृत होते हैं, अर्थात, प्राथमिक संरचना और सहसंयोजक बंधनों को छोड़कर, सभी हाइड्रोजन बांड और हाइड्रोफोबिक बांड नष्ट हो जाते हैं, और हाइड्रोफोबिक साइड चेन पूरी तरह से उजागर हो गई हैं।

यूरिया और गुआनिडाइन हाइड्रोक्लोराइड मध्यम शक्ति वाले डिनाट्यूरेंट्स हैं, जिन्हें डायलिसिस और अल्ट्राफिल्ट्रेशन द्वारा आसानी से हटा दिया जाता है। यूरिया की सामान्य सांद्रता 8-10M, गुआनिडीन हाइड्रोक्लोराइड 6-8M। यूरिया विघटन में गैर-आयनीकरण, तटस्थ, कम लागत के फायदे हैं, पुनरुद्धार के बाद प्रोटीन को हटाने से बड़ी मात्रा में प्रोटीन वर्षा नहीं होगी, और भंग समावेशन निकायों को विभिन्न क्रोमैटोग्राफिक तरीकों से शुद्ध किया जा सकता है, इसलिए इसका व्यापक रूप से उपयोग किया गया है .

 

समावेशन शरीर प्रोटीन रीफोल्डिंग:

कार्यात्मक प्रोटीन बनाने के लिए घुले हुए पुनः संयोजक प्रोटीन को सही ढंग से मोड़ना चाहिए। पुनर्संरचना की तकनीकों में प्रोटीन घोल को लगभग तटस्थ तक पतला करना, विकृतीकरण को हटाना, स्तंभ पर पुनर्संरचना और जेल निस्पंदन क्रोमैटोग्राफी शामिल हैं। उनमें से, प्रोटीन घोल को लगभग तटस्थ तक पतला करना और डिनाटुरेंट को हटाना पुनर्संरचना की एक सामान्य शास्त्रीय विधि है, विशेष रूप से तनुकरण पुनर्संरचना विधि की उपयोग दर सबसे अधिक है।

विकृतीकरण निष्कासन:

डायलिसिस: लाभ यह है कि मात्रा में वृद्धि नहीं होती है, और बाहरी पारगम्य तरल की सांद्रता को धीरे-धीरे कम करके डिनाटुरेंट की निष्कासन दर को नियंत्रित किया जाता है, लेकिन इसमें लंबा समय लगता है और निष्क्रिय प्रोटीन समुच्चय बनाना आसान होता है, जो इसके लिए उपयुक्त नहीं है। बड़े पैमाने पर संचालन और इसे उत्पादन पैमाने पर लागू नहीं किया जा सकता है।

अल्ट्राफिल्ट्रेशन (टीएफएफ): डायलिसिस गति को नियंत्रित करना आसान है, चाहे वह अनुसंधान और विकास, पायलट परीक्षण या उत्पादन में हो, अल्ट्राफिल्ट्रेशन (टीएफएफ) के माध्यम से विकृतीकरण (तरल परिवर्तन + एकाग्रता) को हटा सकता है।

 

समावेशन शरीर प्रोटीन शुद्धि:

पुनरुद्धार के बाद प्रोटीन शुद्धिकरण के तरीके घुलनशील प्रोटीन शुद्धिकरण के समान हैं, अर्थात् आयन एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी, जेल निस्पंदन क्रोमैटोग्राफी, आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी, अमोनियम सल्फेट नमक-आउट वर्षा, आदि।

समावेशन निकायों में कोई जैविक गतिविधि नहीं होती है, प्रोटीन गतिविधि के नुकसान के बारे में चिंता करने की कोई आवश्यकता नहीं है, और बड़ी मात्रा में अभिव्यक्ति से कोशिका मृत्यु नहीं होगी, और प्रोटीज हमले के प्रतिरोध को अधिकतम किया जा सकेगा। जूलिंग खोखले फाइबर को समावेशन निकायों की डाउनस्ट्रीम शुद्धिकरण प्रक्रिया में लचीले ढंग से लागू किया जा सकता है। समावेशन शरीर धोने के चरण में, उत्कृष्ट प्रदर्शन, केन्द्रापसारक धुलाई की तुलना में, स्पर्शरेखा प्रवाह निस्पंदन धोने के लिए नौ आयु प्रौद्योगिकी माइक्रोफिल्ट्रेशन खोखले फाइबर का उपयोग प्रक्रिया के समय को काफी कम कर सकता है, और सामान्य पुनर्प्राप्ति दर 90% से अधिक तक पहुंच सकती है। जूलिंग खोखले फाइबर का उपयोग समावेशन निकायों के प्रोटीन पुनर्रचना चरण में भी किया जा सकता है। माइक्रोफिल्ट्रेशन खोखले फाइबर द्वारा फ़िल्टर किए गए फ़ीड तरल की मैलापन काफी कम हो जाएगी, और प्रोटीन पुनर्प्राप्ति दर अधिक होगी; अल्ट्राफिल्ट्रेशन खोखले फाइबर का उपयोग न केवल विकृतीकरण को हटा सकता है, बल्कि क्रोमैटोग्राफिक नमूना लोडिंग समय को भी कम कर सकता है, ताकि समय की बचत हो, भराव की मात्रा कम हो और उत्पादन लागत कम हो। माइक्रोफिल्ट्रेशन/अल्ट्राफिल्ट्रेशन खोखले फाइबर की पुनर्प्राप्ति दर विभिन्न सामग्रियों के साथ भिन्न होती है, और सामान्य पुनर्प्राप्ति दर 90-95% तक पहुंच सकती है।

गाइडलिंग टेक्नोलॉजी संबंधित समीक्षाओं के लिए परीक्षण किट का अनुरोध करने के लिए आपका स्वागत करती है।

 

गाइडलिंग के बारे में

गाइडलिंग टेक्नोलॉजी एक राष्ट्रीय उच्च तकनीक उद्यम है जो बायोफार्मास्यूटिकल्स, सेल कल्चर, बायोमेडिसिन, निदान और औद्योगिक तरल पदार्थों की शुद्धि और एकाग्रता पर ध्यान केंद्रित करता है। हमने सेंट्रीफ्यूगल फिल्टर डिवाइस, अल्ट्राफिल्ट्रेशन और माइक्रोफिल्ट्रेशन कैसेट, वायरस फिल्टर, टीएफएफ सिस्टम, डेप्थ फिल्टर, हॉलो फाइबर आदि सफलतापूर्वक विकसित किए हैं, जो बायोफार्मास्यूटिकल्स, सेल कल्चर आदि के अनुप्रयोग परिदृश्यों को पूरी तरह से पूरा करते हैं। हमारे झिल्ली और झिल्ली फिल्टर व्यापक रूप से पूर्व-निस्पंदन, माइक्रोफिल्ट्रेशन, अल्ट्राफिल्ट्रेशन और नैनोफिल्ट्रेशन की एकाग्रता, निष्कर्षण और पृथक्करण में उपयोग किए जाते हैं। छोटी, एकल-उपयोग प्रयोगशाला निस्पंदन से लेकर उत्पादन निस्पंदन सिस्टम, बाँझपन परीक्षण, किण्वन, सेल संस्कृति और अधिक तक हमारी कई उत्पाद लाइनें, परीक्षण और उत्पादन की जरूरतों को पूरा करती हैं। गाइडलिंग टेक्नोलॉजी आपके साथ सहयोग करने के लिए तत्पर है!