डाउनस्ट्रीम अल्ट्राफिल्ट्रेशन/डायफिल्ट्रेशन एकाग्रता प्रक्रिया: लक्ष्य प्रोटीन के पारगमन और हानि को प्रभावी ढंग से कैसे रोकें

डाउनस्ट्रीम अल्ट्राफिल्ट्रेशन/डायफिल्ट्रेशन एकाग्रता प्रक्रिया: लक्ष्य प्रोटीन पारगम्यता और हानि को प्रभावी ढंग से कैसे रोकें

पुनः संयोजक प्रोटीन, रक्त उत्पादों और अन्य बायोलॉजिक्स के लिए डाउनस्ट्रीम शुद्धिकरण प्रक्रियाओं में, अल्ट्राफिल्ट्रेशन/डायफिल्ट्रेशन (यूएफ/डीएफ) का उपयोग फीडस्टॉक एकाग्रता, बफर एक्सचेंज और लवण और छोटे -अणु अशुद्धियों को हटाने के लिए किया जाता है। पृथक्करण झिल्ली छानने के आधार पर प्राप्त किया जाता है: मोनोक्लोनल एंटीबॉडीज (एमएबीएस) जैसे बड़े अणु झिल्ली द्वारा बनाए रखे जाते हैं, जबकि लवण, एंडोटॉक्सिन, मुक्त मेजबान सेल प्रोटीन (एचसीपी), और अन्य छोटे अणु अशुद्धियां झिल्ली से गुजरती हैं और पर्मेट में हटा दी जाती हैं। प्रक्रिया पैमाने के दौरान, झिल्ली के माध्यम से लक्ष्य प्रोटीन की हानि आसानी से हो सकती है, जिससे सीधे उपज कम हो जाती है और बैच लागत बढ़ जाती है। कुछ परिचालन स्थितियों में, पर्मेट में प्रोटीन का पता लगाया जा सकता है, जिसके लिए तेजी से निर्धारण की आवश्यकता होती है कि क्या लीक हुए घटक बरकरार लक्ष्य एमएबी, अपमानित/खंडित समुच्चय, या मेजबान सेल प्रोटीन हैं। इस लेख को दो प्रमुख भागों में विभाजित किया गया है: यह पारंपरिक प्रक्रिया नियंत्रण दृष्टिकोणों की समीक्षा करता है और, डिज़ाइन ऑफ़ एक्सपेरिमेंट्स (डीओई) के संयोजन में, एक मजबूत प्रक्रिया विंडो स्थापित करता है, जो कि पर्मेट में पाए गए प्रोटीन की पहचान निर्धारित करने के लिए कई विश्लेषणात्मक तरीकों द्वारा समर्थित है।

 

 

I. यूएफ/डीएफ के दौरान झिल्ली के माध्यम से लक्ष्य प्रोटीन के प्रवेश के प्रमुख कारण

1. अत्यधिक ट्रांसमेम्ब्रेन दबाव (टीएमपी)
जब झिल्ली पर दबाव का अंतर बहुत अधिक होता है, तो विलायक खिंचाव बढ़ जाता है, जिससे कुछ मोनोमेरिक प्रोटीन को पर्मेट में प्रवेश करना पड़ता है। स्केल अप के दौरान, फ़ीड टैंक में बड़ी मात्रा में सामग्री होती है और पाइपिंग में दबाव में उतार-चढ़ाव अधिक स्पष्ट होता है, जिससे प्रयोगशाला पैमाने की तुलना में क्षणिक अधिक दबाव की संभावना अधिक होती है।

2. अनुचित स्पर्शरेखा प्रवाह दर
यदि प्रवाह दर बहुत कम है, तो झिल्ली की सतह पर एक घनी सांद्रता ध्रुवीकरण परत बन जाती है, और स्थानीय प्रोटीन सांद्रता झिल्ली की सहनशीलता सीमा से अधिक हो सकती है। यदि प्रवाह दर बहुत अधिक है, तो कतरनी तनाव एमएबी के संरचनात्मक दरार का कारण बन सकता है, जिससे छोटे प्रोटीन टुकड़े उत्पन्न होते हैं जो झिल्ली छिद्रों से स्वतंत्र रूप से गुजर सकते हैं।

3. फीडस्टॉक में अत्यधिक उच्च प्रोटीन सांद्रता
जब फ़ीड में प्रोटीन की मात्रा बहुत अधिक होती है, तो प्रोटीन झिल्ली की सतह पर जमा हो जाता है, और कुछ मोनोमेरिक प्रोटीन को पर्मेट में ले जाया जा सकता है। बड़े पैमाने पर उत्पादन में यह एक आम समस्या है।

4. प्रक्रिया सीमा के बाहर पीएच या चालकता
प्रोटीन की आवेश विशेषताओं में परिवर्तन से इसकी जलयोजन त्रिज्या और स्पष्ट कण आकार कम हो सकता है, जिसके परिणामस्वरूप असामान्य झिल्ली पारगम्यता हो सकती है।

5. झिल्ली कैसेट की उम्र बढ़ना, उच्च विसरित प्रवाह, या अपर्याप्त पूर्व {{1}कंडीशनिंग
झिल्ली कैसेट में शारीरिक दोष सीधे प्रोटीन रिसाव का कारण बन सकते हैं और उपकरण से संबंधित जोखिम का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं। अत्यधिक क्षारीय समाधानों के साथ बार-बार सीआईपी पॉलीइथर्सल्फोन (पीईएस) झिल्ली सामग्री को धीरे-धीरे नुकसान पहुंचा सकता है।

6. अत्यधिक डायफिल्ट्रेशन मात्रा
लंबे समय तक डायफिल्टरेशन के दौरान, निरंतर विलायक फ्लशिंग धीरे-धीरे थोड़ी मात्रा में मोनोमेरिक प्रोटीन को बाहर ले जा सकती है।

 

द्वितीय. लक्ष्य प्रोटीन के प्रवेश और हानि को रोकने के लिए पारंपरिक व्यावहारिक उपाय

(ए) प्रक्रिया पैरामीटर नियंत्रण

1. ट्रांसमेम्ब्रेन दबाव (टीएमपी) को नियंत्रित करें
ऊपरी दबाव चेतावनी सीमा को परिभाषित करें और झिल्ली परत पर क्षणिक उच्च दबाव प्रभाव को रोकने के लिए इंटरलॉक अलार्म स्थापित करें। छोटे पैमाने पर बेसलाइन पैरामीटर निर्धारित करने के बाद, बड़े पैमाने पर उत्पादन के दौरान सुरक्षित परिचालन दबाव को कम करें और एक उचित प्रक्रिया सहनशीलता सीमा आरक्षित करें।

2. क्रॉसफ्लो दर को अनुकूलित करें
एक स्थिर सीमा परत स्थापित करें और क्रॉसफ्लो के माध्यम से झिल्ली की सतह पर एकाग्रता ध्रुवीकरण को कम करें, जिससे स्रोत पर झिल्ली की सतह पर प्रोटीन का संचय कम हो।

3. एकाग्रता के बाद अंतिम एकाग्रता को सीमित करें
प्रोटीन के भौतिक-रासायनिक गुणों के आधार पर सांद्रण सीमा निर्धारित करें और अत्यधिक फ़ीड सांद्रण से बचें। mAbs के लिए, नियमित अंतिम सांद्रता आम तौर पर 50 mg/mL से अधिक नहीं होती है; कुछ एकत्रीकरण -प्रवण mAbs के लिए, सांद्रता को और कम किया जाना चाहिए।

4. फ़ीड पीएच और चालकता को नियंत्रित करें
प्रोटीन के एक स्थिर हाइड्रेटेड कण आकार को बनाए रखें और एसिड/बेस या आयनिक शक्ति गड़बड़ी के कारण होने वाले आणविक संकुचन से बचें।

(बी) उपकरण और परिचालन नियंत्रण

1. प्रत्येक बैच से पहले झिल्ली कैसेट अखंडता परीक्षण करें
टूटे हुए झिल्ली रेशों की पहचान करने के लिए प्रत्येक बैच के उत्पादन से पहले एक बुलबुला बिंदु परीक्षण आयोजित करें। निरंतर प्रोटीन रिसाव को रोकने के लिए क्षतिग्रस्त झिल्ली कैसेट को तुरंत हटा दिया जाना चाहिए।

2. सीआईपी सफाई प्रक्रिया का मानकीकरण करें
NaOH सांद्रता और संपर्क समय को नियंत्रित करें। दृढ़ता से क्षारीय सफाई के बाद, झिल्ली छिद्र विरूपण के जोखिम को कम करने के लिए झिल्ली सामग्री को पूरी तरह से संतुलित करें।

3. चरणबद्ध डायफिल्ट्रेशन का उपयोग करें
प्रारंभिक चरण के दौरान लवणों को हटाने के लिए एक बड़े वॉल्यूम बफर एक्सचेंज का उपयोग करें, और प्रोटीन ड्रैग और हानि को कम करने के लिए समापन बिंदु के करीब आने पर डायफिल्ट्रेशन प्रवाह दर को धीमा कर दें।

 

तृतीय. डीओई के माध्यम से एक प्रक्रिया डिजाइन स्थान की स्थापना (क्यूबीडी प्रक्रिया विशेषता; आईएनडी सबमिशन के लिए लागू)

1. फैक्टर स्क्रीनिंग
स्क्रीन पांच प्रमुख यूएफ/डीएफ प्रक्रिया पैरामीटर (पी): ट्रांसमेम्ब्रेन दबाव, फ़ीड प्रवाह दर, प्रारंभिक प्रोटीन एकाग्रता, फ़ीड पीएच और ऑपरेटिंग तापमान।
प्रतिक्रिया चर: बरकरार रखी गई उपज, पर्मेट में प्रोटीन सामग्री, झिल्ली प्रवाह, और उच्च {{0}आणविक -वजन समुच्चय का प्रतिशत।

महत्व विश्लेषण के माध्यम से, प्रोटीन रिसाव में योगदान देने वाले प्रमुख कारकों की पहचान करें।

2. प्रतिक्रिया सतह मॉडलिंग
प्रतिक्रिया सतह बनाने और मापदंडों के बीच बातचीत का विश्लेषण करने के लिए उच्चतम महत्व वाले चार मापदंडों का चयन करें। कई परिचालन स्थितियों के तहत, एक एकल पैरामीटर अपनी योग्य सीमा के भीतर रह सकता है, जबकि दो मापदंडों के संयोजन के परिणामस्वरूप प्रोटीन पारगमन हो सकता है। इस तरह के अंतःक्रियात्मक प्रभावों को पारंपरिक एक कारक{{3}पर{{4}एक{5}समय प्रयोगों के माध्यम से पहचाना नहीं जा सकता है। मॉडल के आधार पर, एक संचालन योग्य डिज़ाइन स्थान परिभाषित करें। जब तक प्रक्रिया पैरामीटर इस सीमा के भीतर रहते हैं, तब तक प्रभावी प्रोटीन प्रतिधारण सुनिश्चित किया जा सकता है जबकि डायफिल्ट्रेशन द्वारा अशुद्धियाँ हटा दी जाती हैं।

3. सबसे खराब स्थिति वाली चुनौती (प्रक्रिया लक्षण वर्णन के लिए आवश्यक)
विनिर्माण परिवर्तनशीलता का अनुकरण करने के लिए परिचालन सीमाओं के चरम पर प्रक्रिया मापदंडों का चयन करें: अधिकतम टीएमपी, न्यूनतम क्रॉसफ़्लो दर, और ऊपरी सीमा प्रोटीन एकाग्रता। सत्यापित करें कि अत्यधिक परिचालन स्थितियों में भी, बड़े पैमाने पर लक्ष्य प्रोटीन हानि नहीं होती है, जिससे सीएमसी समीक्षा आवश्यकताओं को पूरा किया जा सके।

 

चतुर्थ. पर्मेट में पाए गए प्रोटीन की पहचान करने और लक्ष्य एमएबी, डिग्रेडेशन फ्रैगमेंट और एचसीपी को अलग करने के लिए कई विश्लेषणात्मक तरीके

विश्लेषणात्मक दक्षता, लागत और नियामक सबमिशन परिदृश्यों के आधार पर, विधियों को दो श्रेणियों में विभाजित किया जा सकता है: रैपिड स्क्रीनिंग और पुष्टिकरण परीक्षण। नियमित प्रक्रिया निगरानी के लिए तीव्र तरीकों को प्राथमिकता दी जानी चाहिए; जब असामान्य विचलन होते हैं, तो सटीक पहचान विधियों का उपयोग किया जाना चाहिए।

1. यूवी स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री (तेजी से ऑनलाइन स्क्रीनिंग; नियमित दुकान के लिए पसंदीदा -फर्श निगरानी)
पर्मिट को इकट्ठा करें और इसकी A280 अवशोषकता को मापें। यह केवल यह निर्धारित कर सकता है कि प्रोटीन पर्मेट में मौजूद है या नहीं और प्रोटीन प्रजातियों को अलग नहीं कर सकता है। इसका उपयोग मुख्य रूप से नियमित प्रक्रिया निगरानी के लिए किया जाता है। लगातार बढ़ता A280 मान बिगड़ते प्रोटीन रिसाव का संकेत देता है और डायफिल्ट्रेशन को तत्काल निलंबित करने और प्रक्रिया की जांच की आवश्यकता होती है।

2. एसडीएस-पेज वैद्युतकणसंचलन (सबसे अधिक इस्तेमाल की जाने वाली गुणात्मक पहचान विधि)
कम करने वाले और गैर कम करने वाले इलेक्ट्रोफोरेसिस का उपयोग करें और फीडस्टॉक में लक्ष्य एमएबी के साथ बैंड की स्थिति की तुलना करें:
1) यदि बैंड की स्थिति लक्ष्य mAb के साथ पूरी तरह से सुसंगत है, तो अक्षुण्ण mAb ने झिल्ली में प्रवेश कर लिया है।
2) यदि निचले {{1}आणविक -वजन बैंड दिखाई देते हैं, तो प्रोटीन हाइड्रोलाइटिक दरार से गुजर गया है, जिससे एमएबी टुकड़े उत्पन्न होते हैं।
3) यदि बैंड कई विविध बैंडों के साथ बिखरे हुए हैं, तो अधिकांश लक्ष्य उत्पाद के बजाय ई. कोली/सीएचओ मेजबान कोशिकाओं से मेजबान सेल प्रोटीन (एचसीपी) हैं।

3. उच्च-प्रदर्शन आकार-बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी (एचपीएसईसी)
आणविक आकार के अनुसार घटकों को अलग करें और फीडस्टॉक क्रोमैटोग्राम के साथ उनके निक्षालन समय की तुलना करें:
- एमएबी के समान अवधारण समय के साथ एक मुख्य शिखर अक्षुण्ण लक्ष्य प्रोटीन को इंगित करता है।
- पहले की गई एक चोटी उच्च {{1}आणविक {{2}वजन वाले समुच्चय/टुकड़ों को इंगित करती है।
- बाद में पीक एल्यूटिंग कम {{1}आणविक {{2}वजन गिरावट वाले टुकड़ों को इंगित करता है।
- एक विशिष्ट मुख्य शिखर की अनुपस्थिति एचसीपी अशुद्धता प्रोटीन को इंगित करती है।
यह विधि मात्रात्मक डेटा प्रदान कर सकती है और प्रक्रिया विचलन जांच रिपोर्ट में शामिल की जा सकती है; क्लिनिकल सबमिशन सामग्रियों में इसकी उच्च स्वीकृति है।

4. एचसीपी होस्ट-सेल प्रोटीन एलिसा किट परीक्षण
यदि पर्मेट में प्रोटीन पाया जाता है, तो एलिसा परिणाम ऊंचा हो जाता है, और एचपीएसईसी कोई विशिष्ट एमएबी शिखर नहीं दिखाता है, लीक हुई सामग्री को मूल रूप से सीएचओ होस्ट - सेल प्रोटीन के रूप में निर्धारित किया जा सकता है। यह अपस्ट्रीम शुद्धिकरण के दौरान अपूर्ण अशुद्धता निष्कासन को इंगित करता है; यूएफ/डीएफ चरण के दौरान अशुद्धियाँ धुल जाती हैं और यह उत्पाद के नुकसान का प्रतिनिधित्व नहीं करता है।

5. एफ़िनिटी क्रोमैटोग्राफी सत्यापन (प्रोटीन ए क्रोमैटोग्राफी)
प्रोटीन A विशेष रूप से mAbs के Fc क्षेत्र को बांधता है। स्तंभ पर पर्मिट नमूना लोड करें: एक विशिष्ट निक्षालन शिखर की उपस्थिति अक्षुण्ण लक्ष्य एंटीबॉडी की उपस्थिति को इंगित करती है; निक्षालन शिखर की अनुपस्थिति दर्शाती है कि पर्मिट में मौजूद प्रोटीन सभी अशुद्धता प्रोटीन हैं।

6. मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस) (गहराई में पता लगाने की क्षमता; प्रमुख प्रक्रिया विचलन की जांच के लिए उपयोग किया जाता है)
एलसी-एमएस सीधे अमीनो एसिड अनुक्रम का विश्लेषण कर सकता है और प्रोटीन की उत्पत्ति का सटीक निर्धारण कर सकता है। इसका उपयोग मुख्य रूप से कठिन या असामान्य विचलन की जांच के लिए किया जाता है और इसे प्रक्रिया नियंत्रण परीक्षण में नियमित रूप से उपयोग नहीं किया जाता है।

V. विभिन्न विश्लेषणात्मक परिणामों के अनुरूप सुधारात्मक कार्रवाइयां

1. पर्मिट में अक्षुण्ण लक्ष्य mAb का पता चला
ट्रांसमेम्ब्रेन दबाव और एकाग्रता के बाद अंतिम एकाग्रता को कम करें; डीओई परिणामों के आधार पर प्रक्रिया संचालन सीमा को सीमित करें; और झिल्ली कैसेट की अखंडता की जाँच करें।

2. पर्मिट में एंटीबॉडी क्षरण के टुकड़े का पता चला
पूरी प्रक्रिया के दौरान कतरनी तनाव और पीएच चरम सीमा की जांच करें; प्रोटीन दरार को कम करने के लिए अपस्ट्रीम वायरल निष्क्रियता चरण को अनुकूलित करें।

3. पर्मेट में केवल एचसीपी अशुद्धता प्रोटीन का पता चला
यूएफ/डीएफ मापदंडों के समायोजन की आवश्यकता नहीं है। समस्या को पिछले क्रोमैटोग्राफी चरणों पर वापस ढूंढें और एफ़िनिटी और आयन एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी के दौरान अशुद्धता हटाने में सुधार करें।

 

VI. सारांश

यूएफ/डीएफ के दौरान प्रोटीन रिसाव को रोकने के लिए, पारंपरिक प्रक्रिया नियंत्रण व्यक्तिगत बिंदु मापदंडों को परिभाषित करने के लिए ऐतिहासिक अनुभव पर निर्भर करता है, जो केवल स्थिर छोटे पैमाने पर उत्पादन को ही पर्याप्त रूप से संबोधित कर सकता है। चरणबद्ध प्रक्रिया पैमाने के दौरान स्थिर प्रदर्शन सुनिश्चित करने के लिए, पर्याप्त सहनशीलता के साथ प्रक्रिया डिजाइन स्थान स्थापित करने के लिए डीओई आधारित प्रक्रिया लक्षण वर्णन का उपयोग किया जाना चाहिए। अंतराल-आधारित पैरामीटर नियंत्रण विनिर्माण परिवर्तनशीलता की भरपाई कर सकता है। एक बार जब पर्मेट में प्रोटीन का पता चल जाता है, तो एक साधारण यूवी डिटेक्शन सिस्टम प्रारंभिक चेतावनी प्रदान कर सकता है, इसके बाद ट्रैसेबिलिटी और पहचान के लिए इलेक्ट्रोफोरेसिस, एचपीएसईसी और एलिसा प्रदान किया जा सकता है। यह लक्ष्य उत्पाद और मेजबान सेल अशुद्धियों के बीच सटीक अंतर करने की अनुमति देता है, जिससे लक्षित रूट जांच और सुधारात्मक कार्रवाई सक्षम हो जाती है। यह भी एक मानकीकृत अनुसंधान घटक है जो वर्तमान में mAb परियोजनाओं के लिए CMC दस्तावेज़ में शामिल है।