झिल्ली प्रौद्योगिकी और टीका स्पष्टीकरण (Ⅱ)

पिछले लेख में, हमने टीकों और टीका स्पष्टीकरण रणनीतियों का कुछ प्रारंभिक परिचय दिया था, और हम इस लेख के बाकी हिस्सों में उनका पता लगाना जारी रखेंगे। उपरोक्त का अनुसरण करते हुए, हम वैक्सीन स्पष्टीकरण और संबंधित झिल्ली ऊतक अनुप्रयोगों को साझा करना जारी रखेंगे।

 

2.2.2 वायरस के भौतिक एवं रासायनिक गुणों का प्रभाव

स्पष्टीकरण चरण में उत्पादन प्रणाली और संबंधित संदूषकों को हटाने के तरीकों पर विचार करने के बाद, वायरस की विशेषताओं को ध्यान में रखना और वायरस की उपज को अधिकतम करने पर ध्यान देना महत्वपूर्ण है।

 

2.2.2.1 आसान वायरस सोखना
गहरे निस्पंदन प्रभाव को बेहतर बनाने के लिए सकारात्मक रूप से चार्ज की गई सामग्री और फिल्टर सहायक (जैसे डायटोमाइट) विकसित किए गए हैं। यद्यपि सकारात्मक चार्ज न्यूक्लिक एसिड और एचसीपी की पकड़ को बढ़ाता है, डायटोमाइट कोशिका मलबे और कोलाइड को बांधने के लिए जाना जाता है। हालाँकि, ये सामग्रियाँ सोखना तंत्र के माध्यम से वायरस को भी बरकरार रख सकती हैं। चूंकि वायरस आमतौर पर समाधान में नकारात्मक रूप से चार्ज होता है, इसलिए सकारात्मक चार्ज वाले फिल्टर के साथ इलेक्ट्रोस्टैटिक इंटरैक्शन हो सकता है।
वायरस कुछ फिल्टर सामग्रियों (जैसे डायटोमाइट या ग्लास फाइबर) के साथ अपने हाइड्रोफोबिक या गैर-विशिष्ट इंटरैक्शन द्वारा भी बंध सकते हैं। लिपटे हुए वायरस, अपने लिपिड आवरण के कारण, इस सोखने के प्रति अधिक संवेदनशील होते हैं। यदि इलेक्ट्रोस्टैटिक इंटरैक्शन के माध्यम से वायरस फिल्टर में अवशोषित हो जाता है, और नमक प्रतिस्पर्धा के कारण वायरस के कण अलग हो जाते हैं, तो अत्यधिक प्रवाहकीय बफर के साथ फिल्टर को धोने से वायरस आंशिक रूप से ठीक हो सकता है। हालाँकि, यह एचसीपी या न्यूक्लिक एसिड जैसे प्रदूषकों को भी ख़त्म कर सकता है। इसलिए, वैकल्पिक फ़िल्टर सामग्री, जैसे कि अधिक निष्क्रिय पॉलीप्रोपाइलीन, के उपयोग को प्राथमिकता दी जाती है।
Adenovirus is easily adsorbed, but different results have been confirmed. Using positively charged diatomite and deep filters. Borosilicate glass fiber filter material is also very well recovered. On the other hand, a patent proposed by Weggeman involving clarification of 20 – 40% adenovirus losses at PER, et al. Cell cultures were prepared with similarly positively charged deep filters containing diatomite. In this case, the nominal polypropylene filter showed a very high viral recovery rate (> 90%).
यह सर्वविदित है कि इन्फ्लूएंजा वायरस में स्पष्टीकरण के दौरान सोखने की हानि होने का खतरा होता है। इसलिए, नो-चार्ज फिल्टर, पॉलीप्रोपाइलीन-आधारित फिल्टर का उपयोग, इन्फ्लूएंजा संग्रह को स्पष्ट करने के लिए उपयुक्त है। थॉम्पसन एट अल ने एमडीसीके कोशिकाओं द्वारा उत्पादित सेल-आधारित इन्फ्लूएंजा वायरस को स्पष्ट करने के लिए नाममात्र रेटेड 1.2 μ मीटर पॉलीप्रोपाइलीन फिल्टर के बाद 0.45 μm पीवीडीएफ झिल्ली के उपयोग की सूचना दी। कुल नौ शुद्धिकरण परीक्षण 20L पैमाने पर किए गए, जिसमें 1.2 μm पॉलीप्रोपाइलीन फिल्टर के लिए 111 L/m2 और 0.45 μm PVDF फिल्टर के लिए 105 L/m2 लोड किया गया। परिणामों से पता चला कि अधिकांश चल रहे वायरस अच्छी तरह से ठीक हो गए (78-154%)। उन्होंने 58% तक एचसीडीएनए हटाने की भी सूचना दी, लेकिन कोई महत्वपूर्ण एचसीपी निष्कासन नहीं हुआ।

 

2.2.2.2 संवेदनशील वायरस को क्लिप करना

कुछ वायरस (एनकैप्सुलेटेड या गैर-एनकैप्सुलेटेड) कम यांत्रिक प्रतिरोध प्रदर्शित करते हैं और सेंट्रीफ्यूजेशन और झिल्ली निस्पंदन चरणों के दौरान कतरनी जोखिम से नष्ट हो सकते हैं। निस्पंदन या क्रोमैटोग्राफी से जुड़े शुद्धिकरण चरणों के दौरान उत्पन्न कतरनी बल के कारण वायरल आवरण गिर सकता है, जिससे संक्रामकता प्रभावित हो सकती है। कैप्सिड के आकार, मोटाई और ज्यामिति के आधार पर, वायरल कैप्सिड भंगुर हो सकता है या, इसके विपरीत, उच्च दबाव के प्रति लचीला हो सकता है। कुछ घिरे हुए वायरस, जैसे इन्फ्लूएंजा वायरस, यांत्रिक तनाव के प्रति लचीले होते हैं और बड़े विरूपण का सामना कर सकते हैं। दूसरी ओर, कतरनी बल के कारण रेट्रोवायरस जैसे कम प्रतिरोधी वायरस का आवरण गिर सकता है, जिससे वायरस की संक्रामकता प्रभावित होती है।

बाह्यकोशिकीय जनित लिफाफा वीएलपी भी बहुत असुरक्षित हैं। केन्द्रापसारक प्रक्रिया में उच्च कतरनी दरें उत्पन्न होती हैं, मुख्य रूप से इनलेट और आउटलेट भागों पर (उच्च कतरनी दरें गैस-तरल इंटरफ़ेस पर उत्पन्न होती हैं)। जब वायरस को ग्रेडिएंट सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा शुद्ध किया गया, तो कुछ रेट्रोवायरस की ट्रांसडक्शन क्षमता काफी कमजोर हो गई थी। केन्द्रापसारक पृथक्करण को डिजाइन करते समय, कतरनी बलों के लिए वायरल कणों की सापेक्ष अस्थिरता पर विचार किया जाना चाहिए। केन्द्रापसारक बल कतरनी झटके का एकमात्र स्रोत नहीं है, उपकरण डिजाइन अधिक महत्वपूर्ण है, विशेष रूप से आयात और निर्यात पर भी महत्वपूर्ण कतरनी झटका है। विभिन्न पैमानों के डिज़ाइन में अंतर के कारण विभिन्न पैमानों पर कतरनी-संवेदनशील वायरस की उपज और पुनर्प्राप्ति में अंतर हो सकता है।

कतरनी-संवेदनशील वायरस को सावधानीपूर्वक डिजाइन किया जाना चाहिए क्योंकि कतरनी तनाव की भयावहता और तनाव के संपर्क में आने का समय (पुनरावृत्ति के कारण) अधिक हो सकता है। कतरनी-संवेदनशील वायरस के लिए, फ़ीड चैनल में अशांति और कतरनी बलों को कम करने के लिए ओपन सर्किट डिवाइस (खोखले फाइबर या खुली प्लेट डिवाइस) को प्राथमिकता दी जाती है।

ऑपरेटिंग मापदंडों के चुनाव से वायरस कणों को होने वाले नुकसान को भी कम करना चाहिए: कम क्रॉस फ्लो, मध्यम ट्रांसमेम्ब्रेन दबाव (टीएमपी), और कम प्रसंस्करण समय।

उच्च दबाव में झिल्ली संदूषण से वायरल संक्रामकता का नुकसान होता है, संभवतः उन ताकतों के कारण जो कतरनी क्रिया वायरल लिफाफे पर कार्य कर सकती है। झिल्ली आधारित पृथक्करण आकार पर आधारित होता है, और बड़े आणविक भार वाले वायरल अवरोधकों और वायरल कणों का संचय वायरल वैक्टर की संक्रामकता को कम कर सकता है।

गहरे निस्पंदन के दौरान कतरनी-संवेदनशील वायरस का क्षरण व्यापक रूप से प्रलेखित नहीं है। गहरे निस्पंदन में वायरस के नुकसान को अक्सर उत्पाद के फंसने, सोखने या समय - और तापमान पर निर्भर वायरल गिरावट के लिए जिम्मेदार ठहराया जाता है। वास्तव में, भले ही एनएफएफ सिस्टम में यांत्रिक तनाव हो सकता है, एनएफएफ उत्पादों के कतरनी के लिए एक्सपोज़र का समय अन्य तकनीकों की तुलना में बहुत कम है क्योंकि एनएफएफ उत्पादों में तेजी से सिंगल पास का अनुभव होता है।

 

2.2.2.3 एपर्चर आकार के अनुसार अवरोधन

माइकोप्लाज़्मा या बाँझ ग्रेड झिल्ली ({{5%).22 μm और नीचे) को हटाकर 1 {{1} 0 एनएम से अधिक के वायरस को बरकरार रखा जा सकता है। ऐसे में फिल्टर के चयन पर विशेष ध्यान देना चाहिए। माइक्रोफिल्ट्रेशन टीएफएफ चरणों के लिए, अच्छे उत्पाद चैनलों के लिए 0.45μm या 0.65μm झिल्ली को प्राथमिकता दी जाती है। एनएफएफ मल्टी-स्टेप निस्पंदन के लिए, सबसे घनी परत 0.45μm से अधिक या उसके बराबर है। गहरे फिल्टर का चयन करते समय सावधानी बरतनी चाहिए, क्योंकि कुछ गहरे फिल्टर उपकरणों में फिल्म की एक परत हो सकती है, जिसके परिणामस्वरूप रिटेंशन ड्राइव से उत्पाद का नुकसान हो सकता है। वायरस एकत्रीकरण वायरस उत्पादन को नकारात्मक रूप से प्रभावित करता है और वायरस के आकार के कारण वायरस प्रतिधारण को बढ़ाता है।

आंद्रे और चैंप्लुवियर के एक पेटेंट के अनुसार, समरूपीकरण समुच्चय के आकार को कम करके, उच्च उपज प्रदान करके फिल्टर क्लॉगिंग को रोक या सीमित कर सकता है। समरूपीकरण से फसल की निस्पंदन क्षमता में भी सुधार हुआ, जो 2. 4-3 गुना बढ़ गया।

बहुत अधिक अशुद्धता वायरस की रिकवरी में बाधा उत्पन्न कर सकती है। अशुद्धियाँ फ़िल्टर को अवरुद्ध कर देती हैं, और झिल्ली के छिद्र बंद होने से वायरस के पारित होने की दर कम हो सकती है। डी वोख्ट और वीनस्ट्रा के एक पेटेंट में, यह उल्लेख किया गया है कि उच्च सेल घनत्व प्रति का प्रत्यक्ष स्पष्टीकरण। TFF({{0}}.65 या 0.2 μm झिल्ली) के साथ संग्रह के परिणामस्वरूप एडेनोवायरस-मुक्त वायरस रिकवरी हुई। 0.65 माइक्रोन टीएफएफ चरण से पहले मेजबान सेल डीएनए के चयनात्मक अवक्षेपण को हटाकर पुनर्प्राप्ति प्राप्त की जा सकती है। 70% एडेनोवायरस।

 

 

2.3 केस अध्ययन: वायरल वैक्सीन स्पष्टीकरण का अनुकूलन

2011 में जैविक प्रक्रियाओं पर अंतर्राष्ट्रीय सम्मेलन में, सनोफी पाश्चर ने उम्मीदवार वायरल टीकों के लिए नए स्पष्ट अनुक्रमों के विकास के लिए स्क्रीनिंग फिल्टर के लिए एक तर्कसंगत दृष्टिकोण प्रस्तुत किया। अनुसंधान का उद्देश्य सेल और वायरस संस्कृति प्रक्रियाओं को अनुकूलित करने में आने वाली समस्याओं को दूर करना है। अपस्ट्रीम प्रक्रिया में संशोधन के परिणामस्वरूप 20% उपज हानि हुई और स्पष्टीकरण चरण के दौरान समय से पहले फिल्टर संदूषण हुआ, जिसके परिणामस्वरूप कोई स्केल-अप नहीं हुआ। एक मजबूत और स्केलेबल स्पष्टीकरण चरण स्थापित करने के लिए, फ़िल्टर अनुक्रम के पूर्ण पुन: विकास की आवश्यकता थी, जिसमें वायरल रिकवरी दर 85% से अधिक थी।

Based on internal experience and scientific publications, the team selected 27 filters for an initial screening study. Small scale virus adsorption tests were performed on various filter media (polypropylene, nylon, cellulose ester, glass fiber, charged adsorption filter) and structures (pleated or deep filter). The virus yield was measured by ELISA and the clarifying efficiency of the preselected filtrate was compared by checking the reduction of turbidity. Preliminary screening studies showed that nylon and charged filters retained viral particles and virus recovery. Ten percent. The virus recovery rate of polypropylene and polyether sulfone filter was >. 80%. सेल्युलोज एस्टर और ग्लास फाइबर फिल्टर की पुनर्प्राप्ति दर फिल्टर के मूल्यांकन (20% या 90%) पर निर्भर करती है।

दूसरे चरण के रूप में, सनोफी पाश्चर ने स्क्रीनिंग अध्ययन में पूर्व-चयनित सात फिल्टर के कई संयोजनों (चरण 2 या चरण 3 अनुक्रम) का मूल्यांकन किया। निरंतर प्रवाह वर्गीकरण परीक्षण एक छोटे फिल्टर के साथ किया गया था। इसके अलावा, इस प्रयोग में स्क्रीनिंग अध्ययन की तुलना में अधिक उपज का उपयोग किया गया। वायरल रिकवरी और फ़िल्टर क्षमता के परिणामों के आधार पर, टीम ने आगे के अध्ययन के लिए दो सर्वोत्तम संयोजनों को चुना।

- अनुक्रम 1 (स्टेज 2): ​​3 0 μm नाममात्र रेटेड फोल्डेड पॉलीप्रोपाइलीन प्रीफ़िल्टर, इसके बाद एक मिश्रित सेलूलोज़ एस्टर और ग्लास फाइबर मल्टीलेयर फ़िल्टर (1/0.5 μm सरंध्रता)

- अनुक्रम 2 (चरण 3): एक ही प्रीफ़िल्टर (30 माइक्रोन नाममात्र रेटेड पॉलीप्रोपाइलीन फ़िल्टर), इसके बाद एक मध्यवर्ती मल्टीलेयर पॉलीप्रोपाइलीन फ़िल्टर और अंत में एक असममित पॉलीथर सल्फोन फिल्म।

 

The robustness of these two clarified sequences has been challenged by repeated constant flow sizing experiments with different harvest batches. While both potential sequences demonstrated enhanced capabilities compared to the reference sequence, only sequence 1 achieved virus recovery objectives (>85%), जैसा कि चित्र 1 में दिखाया गया है।

चित्र 1 प्रत्येक फ़िल्टरिंग चरण पर औसत वायरस पुनर्प्राप्ति। स्थिरता अध्ययनों का मूल्यांकन तीन निस्पंदन अनुक्रमों के लिए किया गया था, जिनमें से केवल अनुक्रम 1 में 3{4}} μm नाममात्र रेटेड फोल्डेड पॉलीप्रोपाइलीन और 1.{5}}/0.5 μm सेलूलोज़ एस्टर और ग्लास फाइबर फिल्टर का उपयोग करके वैश्विक पुनर्प्राप्ति लक्ष्य पूरा किया गया था। .

सेंट्रीफ्यूजेशन का मूल्यांकन प्राथमिक स्पष्टीकरण चरण के रूप में भी किया गया, इसके बाद {{0}}.45 μm का अंतिम निस्पंदन किया गया। कई गति/अवधि युग्मों का परीक्षण किया गया। हालाँकि 0.45 μm की निस्पंदन दर दो गुना बढ़ गई थी, अंतिम उपज 85% के लक्ष्य से कम थी। परिणामस्वरूप, सेंट्रीफ्यूजेशन का आगे अध्ययन नहीं किया गया है।

अंत में, पॉलीप्रोपाइलीन और ग्लास फाइबर निस्पंदन अनुक्रमों के प्रदर्शन का मूल्यांकन बड़े पैमाने (160 एल बायोरिएक्टर आकार) पर किया गया। फ़िल्टर अनुक्रम चित्र 2 में दिखाया गया है।

चित्र 2 फ़िल्टर संयोजन और स्ट्रिंग की चरण उपज का ग्राफिकल प्रतिनिधित्व स्पष्ट करता है। ट्रेन ए पारंपरिक प्रक्रिया है और ट्रेन बी अनुकूलित प्रक्रिया है। अनुकूलित अनुक्रम बी पूर्व-निस्पंदन क्षेत्र को 3 गुना कम कर सकता है, मध्यवर्ती निस्पंदन चरण को रद्द कर सकता है, और अंतिम निस्पंदन क्षेत्र को 10 गुना कम कर सकता है, इस प्रकार वैश्विक वायरस रिकवरी में 3% की वृद्धि हो सकती है।

कई बैचों को फ़िल्टर अवरोध के कोई संकेत नहीं, उत्पादन सीमा के अनुरूप प्रक्रिया समय और > 85 प्रतिशत की वायरस उपज के साथ सफलतापूर्वक स्पष्ट किया गया था। स्पष्टीकरण चरण अनुकूलन का डाउनस्ट्रीम चरणों और वैक्सीन की प्रमुख गुणवत्ता विशेषताओं पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा। इसलिए, चयनित स्पष्टीकरण अनुक्रम का उपयोग वैक्सीन उत्पादन प्रक्रिया (1000 एल आकार के बायोरिएक्टर) में किया गया था और प्रदर्शन की सफलतापूर्वक पुष्टि की गई थी।

 

03 जीवाणु टीकों का स्पष्टीकरण

3.1 जीवाणु टीकों के स्पष्टीकरण के लिए विचार

मेडिकल थिसॉरस (2015) के अनुसार, एक बैक्टीरियल वैक्सीन को पतला या मारे गए बैक्टीरिया या उनके एंटीजेनिक डेरिवेटिव के निलंबन के रूप में परिभाषित किया जाता है जिसका उपयोग बैक्टीरिया रोगों को रोकने या इलाज करने के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया उत्पन्न करने के लिए किया जाता है। अधिक सामान्यतः, सक्रिय एंटीजन के प्रकार के आधार पर जीवाणु टीकों को चार उप-श्रेणियों में विभाजित किया जा सकता है। यह एजेंट हो सकता है:

- संपूर्ण जीवित जीवाणुओं को मार देता है या कमजोर कर देता है। इसे बीसीजी वैक्सीन के नाम से भी जाना जाता है।

- एंटीजेनिक निर्धारकों (सबयूनिट टीके) का शुद्धिकरण। एंथ्रेक्स वैक्सीन या अकोशिकीय पर्टुसिस वैक्सीन।

- बैक्टीरियल टॉक्सिन्स (टॉक्सोइड्स)। डिप्थीरिया और टेटनस टॉक्सोइड्स।

- प्लाज्मिड (पीडीएनए)।

परिवार के उत्पादों की व्यापक विविधता के कारण, अपस्ट्रीम और डाउनस्ट्रीम प्रक्रिया की चुनौतियाँ काफी हद तक उत्पादित किए जा रहे टीके के प्रकार पर निर्भर करती हैं। इसलिए, प्रारंभिक किण्वन चरण के बाद शुद्ध किया जा सकता है या शुद्ध नहीं किया जा सकता है, ताकि स्पष्टीकरण चरण को पूरा किया जा सके।

 

3.2 जीवाणु टीका स्पष्टीकरण रणनीति

3.2.1 टॉक्सोइड

टीके के उपयोग के लिए उत्पादित दो सबसे आम टॉक्सोइड डिप्थीरिया और टेटनस हैं, जो क्रमशः कोरिनेबैक्टीरियम डिप्थीरिया और क्लॉस्ट्रिडियम टेटानी द्वारा उत्पादित होते हैं। दोनों टीकों का उत्पादन सख्त नियामक आवश्यकताओं के अधीन है। डब्ल्यूएचओ की तकनीकी रिपोर्ट और उसके अनुबंध टेटनस और डिप्थीरिया टीकों की गुणवत्ता, सुरक्षा और प्रभावशीलता सुनिश्चित करने के लिए स्पष्ट सिफारिशें करते हैं। सामान्य अच्छी विनिर्माण प्रथाएं दोनों टीकों के उत्पादन पर लागू होती हैं, और कर्मचारियों को उचित रूप से प्रशिक्षित किया जाना चाहिए और दोनों बीमारियों के खिलाफ बूस्टर टीकाकरण प्राप्त करना चाहिए।

जीएमपी के लिए सख्ती से आवश्यक है कि अंतिम उत्पाद की शुद्धता और गुणवत्ता प्रदर्शित की जानी चाहिए। डब्ल्यूएचओ और ईपी के अनुसार, अंतिम टेटनस वैक्सीन की प्रभावकारिता को टेटनस टॉक्सोइड के लिए अंतर्राष्ट्रीय मानक के अनुसार अंतरराष्ट्रीय इकाइयों में कैलिब्रेटेड उचित संदर्भ पदार्थ के साथ विवो में या किसी अन्य सिद्ध विधि के साथ तुलना करके निर्धारित किया जाना चाहिए। प्रभावकारिता के लिए अद्यतन आवश्यकताएँ 2011 में प्रकाशित की गईं और मूल्यांकन की विधि के आधार पर भिन्न हो सकती हैं। टीके के प्रत्येक बैच की सुरक्षा (विष-मुक्त और पुनर्स्थापनात्मक विषाक्तता) का भी प्रदर्शन किया जाना चाहिए। अंत में, टीकों की स्थिरता, विशेष रूप से वास्तविक समय में, पर ध्यान दिया जाना चाहिए।

 

3.2.2 प्लास्मिड डीएनए वैक्सीन

प्लास्मिड डीएनए टीकों का उपयोग पशु स्वास्थ्य उद्देश्यों के लिए किया जाता है, और मानव उपयोग के लिए कई प्लास्मिड डीएनए टीके विकास और नैदानिक ​​​​मूल्यांकन के विभिन्न चरणों में हैं। ई. कोली किण्वन के बाद, बैक्टीरिया को एकत्र किया जाता है और प्लास्मिड डीएनए जारी करने के लिए विभाजित किया जाता है।

कोशिका मलबे को हटाना आमतौर पर सेंट्रीफ्यूजेशन या निस्पंदन द्वारा पूरा किया जाता है। हाल के प्रकाशनों में इस विषय को व्यापक रूप से कवर किया गया है। इस प्रकाशन में, वर्तमान अपस्ट्रीम, डाउनस्ट्रीम और फॉर्मूलेशन pDNA प्रक्रियाएं और चुनौतियाँ।

लेखक विशिष्ट pDNA विनिर्माण प्रक्रिया के प्रत्येक चरण में अंतराल और संभावित भविष्य के नवाचारों और/या वर्तमान प्रौद्योगिकी अंतराल के बारे में भी जानकारी प्रदान करते हैं जिससे आगे की प्रक्रिया अनुकूलन हो सकता है।

प्लास्मिड डीएनए टीके दो चरणों में तैयार किए जाते हैं। सबसे पहले, जीवाणु कोशिकाओं को संवर्धन माध्यम से हटा दिया जाता है, और दूसरा, कोशिका लसीका के बाद कोशिका का मलबा हटा दिया जाता है। पैमाने के आधार पर, कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूजेशन या टीएफएफ माइक्रोफिल्ट्रेशन का उपयोग करके एकत्र किया जाता है। डिस्क-पाइल सेंट्रीफ्यूज को उच्च गति पर रुक-रुक कर बाहर निकाला जाता है, और डिस्चार्ज के दौरान कतरनी क्षति के कारण सुपरकोइल्ड प्लास्मिड की उपज खराब होती है। यदि सेंट्रीफ्यूजेशन का उपयोग किया जाना है, तो एक ठोस कटोरा सेंट्रीफ्यूज सबसे अच्छा है। ओपन चैनल, 0.1 या 0.2 माइक्रोन माइक्रोफिल्ट्रेशन झिल्ली या खोखले फाइबर डिवाइस वाले फ्लैट टीएफएफ डिवाइस अच्छी तरह से काम कर सकते हैं।

क्योंकि खोखले फाइबर उपकरणों में उच्च ठोस भार क्षमता होती है, इसलिए उन्हें कभी-कभी प्राथमिकता दी जाती है। आमतौर पर ये प्रक्रियाएँ सांद्रण के 3-5 गुना पर संचालित होती हैं, इसके बाद ट्रांसफ़िल्टरेशन की मात्रा 3-5 होती है। कतरनी को कम करने और झिल्ली ध्रुवीकरण को बेहतर ढंग से नियंत्रित करने के लिए, प्रवेश नियंत्रण संचालन की अत्यधिक अनुशंसा की जाती है। यद्यपि बड़े पैमाने पर वाणिज्यिक संचालन में सेंट्रीफ्यूज अधिक लागत प्रभावी होते हैं, छोटे पैमाने की प्रक्रियाएं पोर्टेबिलिटी और संचालन में आसानी के कारण निस्पंदन का उपयोग करती हैं।

प्रसंस्करण को सुविधाजनक बनाने के लिए फ़्लोकुलेंट का उपयोग किया गया है, लेकिन इससे उत्पाद हानि हो सकती है। कुछ लोग अक्रिय डायटोमेसियस पृथ्वी कणों का उपयोग करने की भी सलाह देते हैं, जिसके बाद बैग निस्पंदन किया जाता है।

Cell lysis produces viscous products, including large particles, cell fragments, soluble impurities, fine colloidal particles, and pDNA. Due to the complexity of the material, removing such fine solids is a difficult separation. Gradient density deep filter or open hole structure (>0.45मी) झिल्ली फिल्टर कोशिका मलबे को हटाने में अच्छे हैं। कोशिका मलबे के मजबूत अवरोध के कारण, कम प्रवाह या कम दबाव वाले निस्पंदन को प्राथमिकता दी जाती है। इस चरण और औद्योगिक पैमाने के बैग फिल्टर के लिए टीएफएफ-आधारित माइक्रोफिल्टर का उपयोग किया गया है। स्थैतिक (मिश्रण पात्र में) और निरंतर (इन-लाइन स्थैतिक मिक्सर का उपयोग करके) क्रैकिंग के लिए अलग-अलग फिल्टर की आवश्यकता होती है।

 

3.3 केस अध्ययन: टेटनस विषाक्त पदार्थों को स्पष्ट करने के लिए सेंट्रीफ्यूजेशन, एनएफएफ और टीएफएफ तरीकों की प्रभावकारिता की तुलना

मुनियांदी एट अल. किण्वन तरल पदार्थ से टेटनस विषाक्त पदार्थों और टॉक्सोइड को स्पष्ट करने के लिए तीन अलग-अलग तरीकों की तुलना की गई, अर्थात् सेंट्रीफ्यूजेशन, गहरी निस्पंदन (एनएफएफ), और टीएफएफ। परीक्षण सामग्री को संशोधित मिलर (एमएमएम) माध्यम का उपयोग करके 4{5}}0L किण्वक में उत्पादित किया गया था। सेंट्रीफ्यूजेशन अध्ययन में, कोशिकाओं को 60 मिनट के लिए 6 × 1 एल कंटेनर में 4000 आरपीएम पर हृदय से अलग किया गया था। टॉक्सोइड रिकवरी का पता लगाने के लिए सतह पर तैरनेवाला के नमूने लिए गए। गहरे निस्पंदन में किण्वन शोरबा को स्पष्ट करने के लिए डायटोमेसियस पृथ्वी और सेलूलोज़ युक्त 0.45μm और 0.22μm गहरे फिल्टर का उपयोग किया जाता है। यह प्रक्रिया 35 डिग्री और 12 पीएसआई के तापमान पर की जाती है।

एक खुले फ्लैट पैनल टीएफएफ मॉड्यूल को टीएफएफ विधि में 0.22μm पीवीडीएफ झिल्ली से थर्मल रूप से जोड़ा जाता है। टीएफएफ-आधारित स्पष्टीकरण प्रक्रिया 23 डिग्री पर 2000 एल/एच की क्रॉस प्रवाह दर पर की गई थी, और स्पष्ट निस्पंद को पारंपरिक टीएफएफ सैंडविच 30 केडी पीईएस झिल्ली का उपयोग करके 25 डिग्री पर 1000 एल/एच की क्रॉस प्रवाह दर पर केंद्रित किया गया था। इस अल्ट्राफिल्ट्रेशन प्रक्रिया में स्पष्ट मांस तरल (लगभग 6L) को 10 बार केंद्रित किया जाता है। उत्पाद की रिकवरी का आकलन करने के लिए सांद्रित रिटेनर नमूनों पर टेटनस टॉक्सोइड परीक्षण किए गए।

गहन निस्पंदन के परिणामस्वरूप उत्पाद पुनर्प्राप्ति दर लगभग 89% थी, टीएफएफ इकाइयों के परिणामस्वरूप उत्पाद पुनर्प्राप्ति दर 97% से अधिक थी। माइक्रोफिल्ट्रेशन और अल्ट्राफिल्ट्रेशन प्रक्रियाएं एनएफएफ प्रक्रिया की तुलना में लगातार उच्च उत्पाद पुनर्प्राप्ति प्रदान करती हैं। ये परिणाम फ़्लोक्यूलेशन परीक्षण (एलएफ) पर आधारित हैं।

 

04पॉलीसेकेराइड टीकों का स्पष्टीकरण

4.1 पॉलीसेकेराइड वैक्सीन स्पष्टीकरण पर विचार

अनयुग्मित/मुक्त पॉलीसैकेराइड टीकों और युग्मित पॉलीसैकेराइड टीकों दोनों की उत्पादन प्रक्रिया एक किण्वक में मेजबान बैक्टीरिया के संवर्धन से शुरू होती है। किण्वन के अंत में, बैक्टीरिया को नष्ट करने और पॉलीसेकेराइड की रिहाई को बढ़ावा देने के लिए बैक्टीरिया को डीओसी (सोडियम डीऑक्सीकोलेट), ट्राइटन®एक्स -100, या अन्य उपयुक्त अभिकर्मकों जैसे सफाई एजेंटों के साथ इलाज किया जा सकता है। बड़ी बैटरी क्षमता के कारण, एनएफएफ के माध्यम से सीधे संग्रह करना आर्थिक रूप से संभव नहीं है क्योंकि थ्रूपुट बहुत कम हो सकता है। इसलिए, कोशिका के गुच्छों को अलग करने के लिए सेंट्रीफ्यूज का उपयोग करना आदर्श विकल्प है। टीएफएफ माइक्रोफिल्ट्रेशन रेंज का भी उपयोग किया जा सकता है। रुचि के पॉलीसेकेराइड युक्त कोशिका-मुक्त केंद्र/प्रवेशक को एनएफएफ गहरी निस्पंदन प्रणाली द्वारा और अधिक स्पष्ट किया जाता है, इसके बाद बायोबैटर निस्पंदन किया जाता है, और फिर आगे शुद्धिकरण के लिए डाउनस्ट्रीम उपचार के लिए आगे बढ़ाया जाता है।

 

4.2 पॉलीसेकेराइड वैक्सीन स्पष्टीकरण रणनीति

4.2.1 प्रथम स्पष्टीकरण प्रक्रिया

किण्वन तरल पदार्थों से कोशिकाओं को अलग करने के लिए सेंट्रीफ्यूजेशन सबसे आम तकनीकों में से एक है। पैमाने के आधार पर, निरंतर सेंट्रीफ्यूजेशन या बैच सेंट्रीफ्यूजेशन का चयन किया जा सकता है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि सफल डाउनस्ट्रीम शुद्धिकरण के लिए सेंट्रीफ्यूजेशन स्थितियों और उनके संचालन का उचित अनुकूलन आवश्यक है। एक विशिष्ट टीएफएफ झिल्ली और छिद्र आकार का चयन करते समय, पॉलीसेकेराइड के आणविक भार को ध्यान में रखना महत्वपूर्ण है, जो अक्सर बड़े और संरचनात्मक रूप से जटिल होते हैं, जिनका आणविक भार लगभग 5 से लेकर 5 केडीए तक होता है। 1000kDa से अधिक तक। बड़े खुले छिद्र आकार के कारण, 0.22μm, 0.45μm, 0.65μm एमएफ झिल्ली का उपयोग आसमाटिक समाधान में पीएस अणुओं की सफल पुनर्प्राप्ति सुनिश्चित कर सकता है।

 

4.2.2 माध्यमिक स्पष्टीकरण प्रक्रिया

द्वितीयक स्पष्टीकरण चरण तक पहुंचने वाले सेल-मुक्त किण्वन समाधान की स्पष्टता/गंदलापन विशिष्ट बैक्टीरिया, दरार प्रकार, व्यक्तिगत सीरम प्रकार और प्राथमिक स्पष्टीकरण चरण के लिए उपयोग की जाने वाली तकनीक पर निर्भर करता है। केंद्र की मैलापन लगभग 50 से 150 एनटीयू तक हो सकती है। भरे हुए सेल्युलोज फाइबर के साथ संसेचित डायटोमाइट से बने एक सकारात्मक रूप से चार्ज किए गए भिन्नात्मक घनत्व वाले गहरे फिल्टर का उपयोग इसकी मैलापन को स्पष्ट करने और कम करने के लिए <5NTU तक किया जा सकता है।

इस गहरे फिल्टर का वॉल्यूम थ्रूपुट लगभग 150 L/m3 से लेकर 25{6}} L/m3 तक हो सकता है। आमतौर पर, स्पष्ट उत्पाद समाधान को किसी भी शेष कोशिका कण, कोलाइड और संभावित सूक्ष्मजीवों को हटाने के लिए बाद के 0.45 माइक्रोन बायोसपोर्टेड रिडक्शन ग्रेड या 0.22 माइक्रोन निष्फल ग्रेड झिल्ली के माध्यम से फ़िल्टर किया जाता है।

 

4.3 केस अध्ययन: सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद स्ट्रेप्टोकोकस न्यूमोनिया किण्वन शोरबा के केंद्र का स्पष्टीकरण

कोशिकाओं को निरंतर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा {{0}}.1% (v/v) टाइप 8 स्ट्रेप्टोकोकस न्यूमोनिया किण्वन शोरबा (20 एल) जोड़कर अलग किया गया था। संग्रह के केंद्र को सेलूलोज़ फाइबर युक्त दो अलग-अलग सकारात्मक चार्ज और डायटोमेसियस पृथ्वी गहरे फिल्टर के माध्यम से फ़िल्टर किया जाता है। व्यक्तिगत गहरे फ़िल्टर फ़िल्ट्रेट को बायोलोडेड रिडक्शन ग्रेड PVDF 0.45μm झिल्ली के माध्यम से फ़िल्टर किया गया था। सभी निस्पंदन परीक्षण पेरिस्टाल्टिक पंपों के साथ निरंतर प्रवाह मोड में किए गए थे। चार्ज किए गए गहरे फिल्टर और स्ट्रेप्टोकोकस न्यूमोनिया सीरोटाइप 8 किण्वन शोरबा का उपयोग करके निस्पंदन परीक्षणों के परिणामस्वरूप लगभग 120 एनटीयू से 3 एनटीयू तक मैलापन कम हो गया। परीक्षण 140,150 L/m2/hr की प्रवाह दर और 20-25 psi के समापन बिंदु दबाव अंतर पर, लगभग 180-200 L/m2 के वॉल्यूम थ्रूपुट के साथ किए गए थे।

स्ट्रेप्टोकोकस न्यूमोनिया सीरोटाइप 19ए के किण्वन शोरबा पर इसी तरह के निस्पंदन परीक्षण किए गए थे। सेंट्रीफ्यूज्ड 19A तरल को एक चार्ज किए गए गहरे फिल्टर के माध्यम से स्पष्ट किया जाता है, जो गंदगी को लगभग 4 {{9 }} NTU से घटाकर 3 NTU कर देता है। परीक्षण लगभग 140-160 एल/एम2/घंटा की निरंतर प्रवाह दर पर किए गए थे, और लगभग 15 पीएसआईडी के अंतिम बिंदु दबाव पर 200-230एल/एम2 का वॉल्यूमेट्रिक थ्रूपुट हासिल किया गया था। निस्पंदन मूल्यांकन परीक्षणों के दौरान एकत्र किए गए उत्पाद नमूनों के एचएलपीसी विश्लेषण से पता चला कि गहरे निस्पंदन या 0.45 माइक्रोन (या 0.22 माइक्रोन) झिल्ली के लिए कोई महत्वपूर्ण उपज हानि नहीं हुई है।

 

05 निष्कर्ष

स्पष्टीकरण प्रक्रियाओं के विकास के लिए सेंट्रीफ्यूजेशन, टीएफएफ-एमएफ, गहरी निस्पंदन और सड़न रोकनेवाला निस्पंदन जैसी कई इकाई प्रक्रियाओं के एकीकरण की आवश्यकता होती है। स्पष्टीकरण प्रक्रिया के अनुकूलन के लिए यह समझने की आवश्यकता है कि विभिन्न इकाई संचालन एक दूसरे को कैसे प्रभावित करते हैं। आज के अधिक कुशल बायोरिएक्टरों द्वारा उत्पादित प्रक्रिया तरल पदार्थों की बढ़ती जटिल आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए प्रौद्योगिकियों और उपकरणों (उपकरण और फिक्स्चर) का चयन करना चुनौती है। अपस्ट्रीम उत्पादकता (वायरल टिटर, सेल घनत्व, आदि), सेल मलबे और सेल लिसिस उत्पादों में वृद्धि से स्पष्टीकरण प्रक्रिया की कठिनाई बढ़ जाती है और पृथक्करण और निस्पंदन उपकरण की पसंद भ्रमित हो जाती है।

प्रक्रिया पैमाने का चयन करते समय उपकरण डिजाइन, उपयोग में आसानी और सफाई पर विचार किया जाना चाहिए। यह खारिज किए गए फ़िल्टर से निपटने के दौरान कुशल रूपांतरण और ऑपरेटर सुरक्षा सुनिश्चित करेगा। स्पष्टीकरण प्रक्रिया को विकसित करने के लिए, यह सुनिश्चित करने के लिए स्पष्टीकरण चरणों का मजबूत एकीकरण महत्वपूर्ण है कि अपस्ट्रीम फसल का प्रसंस्करण लागत प्रभावी है। प्रयोगशाला परीक्षण, पायलट उत्पादन और पूर्ण आकार प्रसंस्करण की सुविधा के लिए निस्पंदन इकाइयों की एक श्रृंखला आसानी से उपलब्ध है। एक अच्छी तरह से डिज़ाइन की गई स्केल-अप कार्य योजना को लागू करके, जो कई स्पष्टीकरण विकल्पों का मूल्यांकन करती है, कोई भी परिचालन लागत को कम करते हुए डाउनस्ट्रीम यूनिट संचालन की सुरक्षा के लिए आत्मविश्वास से स्पष्टीकरण फ़िल्टर का चयन और आकार कर सकता है।

वैक्सीन स्पष्टीकरण कई चुनौतियाँ प्रस्तुत करता है। आमतौर पर, निस्पंदन प्रक्रिया को उत्पादन प्रणाली, निष्क्रियता या लसीका एजेंट और एंटीजन प्रस्तुति के अनुरूप बनाया जाना चाहिए, जरूरी नहीं कि टीके। पारंपरिक वैक्सीन प्रक्रियाएं आमतौर पर वैक्सीन को शुरू में स्पष्ट करने के लिए सेंट्रीफ्यूजेशन का उपयोग करती हैं। कई प्रौद्योगिकी प्लेटफार्मों और छोटे प्रसंस्करण संस्करणों के साथ आधुनिक टीके टीकों को झिल्ली-आधारित प्रौद्योगिकियों द्वारा स्पष्टीकरण के लिए अधिक उपयुक्त बनाते हैं। आधुनिक सेल लाइनों और अभिव्यक्ति प्रणालियों का उपयोग करके और अधिक परिभाषित सेल संस्कृति स्थितियों का उपयोग करके नए विकसित टीके कई वैक्सीन प्रक्रियाओं को निस्पंदन के लिए अधिक अनुकूल बनाते हैं।

 

हालाँकि, वैक्सीन उत्पादों के एंटीजेनिक घटक या "लक्ष्य एंटीजन" में विविधता निस्पंदन स्पष्टीकरण की जटिलता को बढ़ा देती है। एंटीजन आकार, सतह रसायन विज्ञान और चार्ज में भिन्न होते हैं। ये विशेषताएँ एंटीजन की उपज और पुनर्प्राप्ति को प्रभावित करती हैं। टीके स्पष्टीकरण के लिए अद्वितीय चुनौतियाँ पेश करते हैं, मुख्यतः उनके मैक्रोमोलेक्यूल्स के आकार के कारण। यह, स्पष्टीकरण के आसपास क्षमता के मुद्दों के साथ मिलकर, प्रक्रिया विकास रणनीतियों पर मार्गदर्शन की आवश्यकता को बढ़ाता है।

वैक्सीन उत्पादन के लिए व्यावसायिक स्तर के ऑपरेशन के आकार और पैमाने का स्पष्टीकरण तकनीक की पसंद पर महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है। प्रक्रिया के अपस्ट्रीम में स्थित होने के कारण, उचित स्पष्टीकरण अनुकूलन डाउनस्ट्रीम इकाई संचालन की सफलता, प्रक्रिया की उपज, पुनर्प्राप्ति और मजबूती को अधिकतम करने के लिए महत्वपूर्ण है। जबकि सेंट्रीफ्यूजेशन प्राथमिक स्पष्टीकरण के लिए एक व्यवहार्य तकनीकी विकल्प बना हुआ है, प्राथमिक स्पष्टीकरण के लिए ओपन चैनल माइक्रोफिल्ट्रेशन इकाइयां (टीएफएफ) और माध्यमिक स्पष्टीकरण के लिए बारीक गहरे फिल्टर या झिल्ली फिल्टर वैक्सीन उद्योग में स्वीकृति प्राप्त कर रहे हैं। यह परिवर्तन तेज़ प्रसंस्करण, तेज़ प्रक्रिया विकास, पोर्टेबल प्रक्रियाओं और एकल-उपयोग कार्यान्वयन की आवश्यकता से प्रेरित है। एनएफएफ छोटे से लेकर बड़े पैमाने पर एकल-उपयोग विकल्पों के लिए उपयुक्त एक किफायती प्रक्रिया प्रदान करता है। बदलती विनियामक आवश्यकताओं के कारण, ऑटोक्लेविंग के लिए डिज़ाइन किए गए गामा विकिरण पूर्व-एसेप्टिक उपकरणों या मॉड्यूल की उपलब्धता एनएफएफ या टीएफएफ आधारित प्रौद्योगिकियों के तेजी से अनुकूलन को बढ़ावा देती है।

कई क्लासिक वैक्सीन प्रक्रियाओं में स्पष्टीकरण इकाई संचालन का विकास शामिल है, जो मुख्य रूप से नियामक बाधाओं और पुनर्वैधीकरण और पुनः सबमिशन या नैदानिक ​​​​परीक्षणों की संबंधित उच्च लागतों के कारण होता है। निस्पंदन आधारित स्पष्टीकरण योजना का उपयोग करने वाली प्लेटफ़ॉर्म प्रक्रिया को उच्च स्तर की सफलता के साथ कई जैविक एजेंटों में व्यापक रूप से उपयोग किया गया है। इस दस्तावेज़ में उल्लिखित उदाहरणों और मामलों से पता चलता है कि वैक्सीन निर्माताओं के पास टेम्पलेट दृष्टिकोण का पालन करके स्थिरता, आर्थिक व्यवहार्यता और एकल-उपयोग उपयोगिता के इस स्तर को प्राप्त करने की क्षमता है।

सेंट्रीफ्यूजेशन की तुलना में निस्पंदन के अन्य लाभ कतरनी संवेदनशील वायरस या वायरस हैं जो वायु इंटरफ़ेस पर जमा होते हैं। जैसे-जैसे उपकरण निर्माता बाज़ार में नए उत्पाद लाएंगे, वैक्सीन निर्माता स्पष्टीकरण प्रक्रिया के लिए बेहतर ढंग से सुसज्जित होते रहेंगे।

 

स्थानीयकरण सर्किट में पहली कंपनी के रूप में, गाइडलिंग टेक्नोलॉजी ने वैक्सीन स्पष्टीकरण में पर्याप्त प्रासंगिक अनुभव अर्जित किया है। गाइडलिंग टेक्नोलॉजी एक विकास और उत्पादन कंपनी है जो बायोफार्मास्युटिकल और सेल कल्चर, शुद्धि और पृथक्करण पर ध्यान केंद्रित करती है। उत्पादों का व्यापक रूप से बायोमेडिसिन, निदान, औद्योगिक द्रव निस्पंदन, पता लगाने, स्पष्टीकरण, शुद्धिकरण और एकाग्रता प्रक्रिया में उपयोग किया जाता है; गाइडलिंग ने सफलतापूर्वक अल्ट्राफिल्ट्रेशन सेंट्रीफ्यूज ट्यूब, अल्ट्राफिल्ट्रेशन/माइक्रोफिल्ट्रेशन मेम्ब्रेन कैसेट, वायरस रिमूवल फिल्टर, टैंगेंशियल फ्लो फिल्टर डिवाइस, डीप मेम्ब्रेन स्टैक आदि विकसित किया है, जो बायोफार्मास्युटिकल और सेल कल्चर के अनुप्रयोग परिदृश्यों को पूरी तरह से पूरा करते हैं।

हमारे झिल्ली और झिल्ली फिल्टर व्यापक रूप से पूर्व-निस्पंदन, माइक्रोफिल्ट्रेशन, अल्ट्राफिल्ट्रेशन और नैनोफिल्ट्रेशन की एकाग्रता, निष्कर्षण और पृथक्करण में उपयोग किए जाते हैं। छोटे एकल-उपयोग प्रयोगशाला निस्पंदन से लेकर उत्पादन-प्रकार निस्पंदन सिस्टम, बाँझपन परीक्षण, किण्वन, सेल संस्कृति और अधिक तक उत्पाद लाइनों की हमारी विस्तृत श्रृंखला, परीक्षण और उत्पादन की जरूरतों को पूरा कर सकती है।