पुनः संयोजक एस्चेरिचिया कोली के उच्च घनत्व किण्वन लाइसेट की स्पष्टीकरण प्रक्रिया पर अध्ययन

 

क्रोमैटोग्राफी में भौतिक द्रव के हस्तक्षेप को कम करने और लक्ष्य प्रोटीन की वसूली में सुधार करने के लिए, पुनः संयोजक एस्चेरिचिया कोली के दो उपभेदों के उच्च घनत्व किण्वन लाइसेट की स्पष्टीकरण प्रक्रिया का अध्ययन किया गया था। स्ट्रेप्टोकोकस सूइस और हीमोफिलस पैरासुइस के प्रमुख जीन को व्यक्त करने वाले स्ट्रेन बीएल 21- एचपी1036 और बीएल 21- पाला का चयन किया गया। मैलापन और वैद्युतकणसंचलन का पता लगाकर प्रोटीन उपज का मूल्यांकन करने के लिए स्पर्शरेखा प्रवाह प्रक्रिया, उच्च गति सेंट्रीफ्यूजेशन प्रक्रिया और झिल्ली कैसेट स्पष्टीकरण प्रक्रिया का उपयोग किया गया था।

 

परिणामों से पता चला कि स्ट्रेप्टोकोकस सूइस और हेमोफिलस पैरासुइस के प्रमुख जीनों को व्यक्त करने वाले बीएल 21- एचपी1036, बीएल 21- पालए उच्च घनत्व किण्वन लाइसेट को झिल्ली कैसेट निस्पंदन और सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा स्पष्ट किया गया था, और प्रोटीन की उपज 80% से अधिक थी, जो क्रोमैटोग्राफिक हस्तक्षेप को प्रभावी ढंग से कम कर सकता है और पुनर्प्राप्ति दर में सुधार कर सकता है।

 

परिचय

वर्तमान में, स्ट्रेप्टोकोकस सुइस (एसएस) और हेमोफिलस पैरासुइस (एचपीएस) सुअर फार्मों में सबसे आम जीवाणु रोग रोगजनक हैं, जो सुअर उद्योग को बहुत नुकसान पहुंचाते हैं। एसएस को कुल 35 सीरोटाइप 1-34 और 1/2 में विभाजित किया जा सकता है, और एचपीएस को 1-15 सीरोटाइप में विभाजित किया जा सकता है, और दोनों अक्सर मिश्रित होते हैं, जो मुख्य रूप से स्वाइन पॉलीसेरोसाइटिस, गठिया, मेनिनजाइटिस, एंडोकार्डिटिस का कारण बनते हैं। , बैक्टीरियल सेप्टिसीमिया और ब्रोंकाइटिस।

 

स्ट्रेप्टोकोकस सुइस और हेमोफिलस पैरासुइस के सीरोटाइप की बड़ी संख्या के कारण, विभिन्न सीरोटाइप के बीच क्रॉस-प्रोटेक्शन कमजोर है, और एंटीबायोटिक दवाओं के साथ इलाज करने पर एंटीबायोटिक प्रतिरोध काफी बढ़ जाएगा, जो चिकित्सीय प्रभाव को प्रभावित करेगा।

 

एसएस और एचपीएस को रोकने के लिए टीके प्रभावी साधनों में से एक बन गए हैं। निष्क्रिय टीके, क्षीण टीके, जीवित टीके, सबयूनिट टीके और आनुवंशिक रूप से इंजीनियर टीके हैं, लेकिन निष्क्रिय टीके और क्षीण टीके मुख्य रूप से बाजार में हैं, और उनकी प्रतिरक्षा सुरक्षा अच्छी है, लेकिन क्रॉस-सुरक्षा स्पष्ट नहीं है। सबयूनिट वैक्सीन स्ट्रेप्टोकोकस सुइस के खिलाफ एक नए प्रकार का टीका है, जो मजबूत क्रॉस-प्रोटेक्शन और कम कीमत वाला एक नए प्रकार का टीका है। स्ट्रेप्टोकोकस सूइस और हेमोफिलस पैरासुइस के सबयूनिट टीकों का अनुसंधान और विकास चीन में सुअर उद्योग को प्रभावित करने वाले स्ट्रेप्टोकोकस सूइस और हेमोफिलस पैरासुइस की रोकथाम और नियंत्रण समस्याओं का एक आदर्श समाधान प्रदान करता है।

 

स्ट्रेप्टोकोकस सुइस और हेमोफिलस पैरासुइस सबयूनिट टीके पुनः संयोजक एस्चेरिचिया कोली द्वारा उच्च घनत्व किण्वन के अधीन हैं। लाइसेट के स्पष्टीकरण का लक्ष्य प्रोटीन की उपज पर बहुत प्रभाव पड़ता है, लेकिन कुछ प्रासंगिक रिपोर्टें हैं। किण्वन और शुद्धिकरण प्रक्रिया के स्पष्टीकरण चरण को कैसे साकार किया जाए यह एक महत्वपूर्ण कार्य है। इस पेपर में, पुनर्योगज ई. कोली बीएल21-एचपी1036, बीएल21-पालए उच्च-घनत्व किण्वन को वस्तु के रूप में, यह अध्ययन करने के लिए कि स्पष्टीकरण समाधान की मैलापन को कुशलतापूर्वक कैसे कम किया जाए, प्रोटीन उपज में सुधार किया जाए, सैद्धांतिक आधार और तकनीकी सहायता प्रदान करने के लिए औद्योगिक क्रशिंग और स्पष्टीकरण प्रौद्योगिकी प्राप्त करने के लिए स्ट्रेप्टोकोकस सुइस सबयूनिट वैक्सीन किण्वन प्रक्रिया।

 

1. सामग्री और विधियाँ

1.1 सामग्री

 

1.1.1 उपभेद

स्ट्रेप्टोकोकस सूइस और हीमोफिलस पैरासुइस स्ट्रेन बीएल21-एचपी1036, बीएल21-पा-एलए

 

1.1.2 मुख्य मीडिया और अभिकर्मक

खमीर अर्क और पोरपोइज़; सोडियम क्लोराइड; कनामाइसिन, आईपीटीजी; फॉर्मेल्डिहाइड से; एसडीएस-पेज जेल किट।

 

1.1.3 मुख्य परीक्षण उपकरण

उच्च घनत्व किण्वक; उच्च गति अपकेंद्रित्र; वैद्युतकणसंचलन उपकरण; पराबैंगनी जेल इमेजिंग प्रणाली; अल्ट्रासोनिक कोल्हू; छोटे उच्च गति अपकेंद्रित्र; पराबैंगनी स्पेक्ट्रोफोटोमीटर; लगातार तापमान मिलाने वाली तालिका; एफ़िनिटी क्रोमैटोग्राफी उपकरण.

 

1.2 विधियाँ

 

1.2.1 उच्च घनत्व किण्वन संस्कृति

योग्य पुनः संयोजक कोलीफॉर्म उपभेदों बीएल 21- एचपी1036 और बीएल 21- पीए-एलए को सिंथेटिक माध्यम पर 2% (वी/वी) पर टीका लगाया गया और 35-40 घंटे के लिए 37 डिग्री पर सुसंस्कृत किया गया।

 

1.2.2 पुनः संयोजक प्रोटीन प्रेरित अभिव्यक्ति

जब किण्वन समाधान OD{0}}±0.1, प्रेरण शुरू हुआ, प्रेरण तापमान 35 डिग्री ±0.5 डिग्री था, और प्रेरण के 10 घंटे के बाद संस्कृति समाप्त हो गई थी।

 

1.2.3 उच्च दबाव सजातीय क्रशिंग और सेंट्रीफ्यूजेशन

निष्क्रियता परीक्षण पास करने वाले बैक्टीरिया तरल को क्रमशः 100 ~ 150 एमपीए के दबाव के साथ, सेल क्रैकिंग के लिए एक उच्च दबाव होमोजेनाइज़र द्वारा कुचल दिया गया था। कुचलने के बाद कुचले हुए तरल को कम तापमान पर रखा जाता था।

सतह पर तैरनेवाला उच्च गति के साथ अपकेंद्रित्र द्वारा प्राप्त किया गया था, केन्द्रापसारक गति: 15 0 00 आरपीएम, तापमान नियंत्रण: 10 डिग्री ~ 15 डिग्री, इंजेक्शन गति: 0.5 ~ 1 एल/मिनट, क्रमशः, सतह पर तैरनेवाला एकत्र किया गया था, और सतह पर तैरनेवाला उन कंटेनरों से भरा हुआ था जो एंडोटॉक्सिन को हटाते थे।

 

1.2.4 माइक्रोफिल्ट्रेशन झिल्ली कैसेट स्पष्टीकरण

झिल्ली को एक दिशा में 1{2}}L शुद्ध पानी से धोया गया था, और स्पर्शरेखीय प्रवाह निस्पंदन किया गया था। सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद टूटे हुए बैक्टीरियल सस्पेंशन का 300 एमएल पाइपलाइन सेंट्रीफ्यूज से लिया गया और 0.45um माइक्रोफिल्ट्रेशन झिल्ली कैसेट के साथ स्पष्ट किया गया। क्रमशः नमूनाकरण द्वारा गंदलापन मापा गया था, और सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद की गंदलापन, माइक्रोफिल्ट्रेशन झिल्ली कैसेट में स्पष्ट तरल की गंदलापन और माइक्रोफिल्ट्रेशन झिल्ली कैसेट में केंद्रित तरल की गंदलापन की तुलना की गई थी। प्रोटीन उपज का मूल्यांकन करने के लिए क्रोमैटोग्राफी और इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा नमूने की प्रोटीन सामग्री का पता लगाया गया था।

 

चरण 2: परिणाम

2.1 बीएल{{2}एचपी1036 और बीएल{4}पाला प्रोटीन का स्पष्टीकरण डेटा और परीक्षण परिणाम

चित्र में परिणाम। 1 दिखाता है कि बीएल 21- एचपी1036 और बीएल {{3} पीएएलए रीकॉम्बिनेंट एस्चेरिचिया कोली क्रशिंग तरल पदार्थ की मैलापन क्रमशः 4 500 एनटीयू और 4 000 एनटीयू से घटकर 1970 एनटीयू और 520 एनटीयू हो गई। ट्यूब सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद. माइक्रोफिल्ट्रेशन मेम्ब्रेन कैसेट विधि द्वारा बीएल 21- एचपी1036 और बीएल {{10} पीएएलए रीकॉम्बिनेंट एस्चेरिचिया कोली की मैलापन को 25 एनटीयू और 1.28 एनटीयू तक कम कर दिया गया था। यह देखा जा सकता है कि माइक्रोफिल्ट्रेशन झिल्ली कैसेट स्पर्शरेखा प्रवाह निस्पंदन और अनुकूलित खुले प्रवाह चैनल का उपयोग पारंपरिक सेंट्रीफ्यूज निस्पंदन की तुलना में क्रोमैटोग्राफिक तरल के एंडोटॉक्सिन, चिपचिपाहट और मैलापन को कम करने पर अच्छा प्रभाव डालता है, और टूटे हुए पुनः संयोजक ई. कोली हेटरोप्रोटीन को काफी कम कर सकता है। और न्यूक्लिक एसिड.

 

2.2 बीएल21-एचपी1036 और बीएल{4}}पालए नमूनों की प्रोटीन पुनर्प्राप्ति

तालिका 1 से पता चलता है कि पुनः संयोजक एस्चेरिचिया कोली बीएल 21- एचपी1036 प्रोटीन माइक्रोफिल्ट्रेशन स्पष्ट समाधान और माइक्रोफिल्टरेशन झिल्ली द्वारा कवर किए गए केंद्रित सतह पर तैरनेवाला दोनों में मौजूद है, और माइक्रोफिल्ट्रेशन स्पष्ट समाधान और केंद्रित सतह पर तैरनेवाला से प्रोटीन को पुनर्प्राप्त करने के बाद कुल प्रोटीन उपज लगभग 88.5% है. बीएल 21-पालए प्रोटीन माइक्रोफिल्ट्रेशन एक्सयूडेट स्पष्ट समाधान और माइक्रोफिल्ट्रेशन झिल्ली कैसेट द्वारा कवर किए गए केंद्रित समाधान के सतह पर तैरनेवाला में भी मौजूद था। बीएल 21-पाला प्रोटीन की कुल उपज 81.5% थी।

 

3. निष्कर्ष

इस पेपर में, स्ट्रेप्टोकोकस सूइस और हीमोफिलस पैरासुइस के प्रमुख जीन बीएल {{{3 }}}} एचपी 1036 और बीएल 21- पीएएलए को व्यक्त करने वाले उपभेदों को क्रमशः उच्च घनत्व किण्वन से गुजरना पड़ा और 0.45 पारित किया गया। सामग्री तरल की मैलापन था यूएम माइक्रोफिल्ट्रेशन मेम्ब्रेन कैसेट प्रक्रिया द्वारा काफी कम किया गया, यह दर्शाता है कि माइक्रोफिल्ट्रेशन मेम्ब्रेन कैसेट के साथ स्पर्शरेखा प्रवाह निस्पंदन तकनीक उच्च गति वाले सेंट्रीफ्यूज की तुलना में बेहतर थी, और टूटे हुए पुनः संयोजक एस्चेरिचिया कोली की अशुद्धता प्रोटीन और न्यूक्लिक एसिड को काफी कम कर सकती है।

 

एकल माइक्रोफिल्ट्रेशन झिल्ली कैसेट में स्पष्ट तरल एकत्र करने के बाद, 62.9% बीएल के लक्ष्य प्रोटीन का 37.1% था। स्पष्टीकरण के लिए दो-चरणीय पद्धति अपनाई गई। पहले चरण में, एक्सयूडेट को स्पष्ट करने और एकत्र करने के लिए 0.45um माइक्रोफिल्ट्रेशन झिल्ली कैसेट का उपयोग किया गया था; दूसरे चरण में, शेष संकेंद्रित तरल को ट्यूब सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद एकत्र किया गया था, और दो चरण वाले स्पष्ट तरल को क्रोमैटोग्राफिक नमूने के रूप में जोड़ा गया था। बीएल 21- पाला किण्वन तरल का मैलापन मूल्य उल्लेखनीय रूप से नहीं बढ़ा, प्रोटीन की उपज तक पहुंच सकती है 85.5% से अधिक, और दो-चरणीय उपचार के बाद बीएल 21- पाला किण्वन तरल की प्रोटीन उपज 81.5% तक पहुंच सकती है।

 

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