मानव रेबीज वैक्सीन के उत्पादन में अल्ट्राफिल्ट्रेशन का अनुप्रयोग

मानव रेबीज वैक्सीन के उत्पादन में अल्ट्राफिल्ट्रेशन के अनुप्रयोग को बढ़ावा देने के लिए, रेबीज वायरस हार्वेस्ट समाधान को केंद्रित करने और अल्ट्राफिल्ट्रेशन के बाद एंटीजन रिकवरी, एंडोटॉक्सिन हटाने की दर और मेजबान प्रोटीन हटाने की दर का पता लगाने के लिए 300kDa अल्ट्राफिल्ट्रेशन झिल्ली कैसेट का उपयोग किया गया था। परिणामों से पता चला कि उचित दबाव में, रेबीज वायरस हार्वेस्ट समाधान 80 बार केंद्रित किया गया था, 25 बार eluted, एंटीजन रिकवरी दर 86.2% थी, बैक्टीरियल एंडोटॉक्सिन हटाने की दर 87.5% ~ 88.7% थी, और मेजबान प्रोटीन हटाने की दर 91.6% थी।

 

प्रस्तावना

 

रेबीज एक पारंपरिक, प्राचीन जूनोटिक बीमारी है जो रेबीज वायरस (आरवी) के कारण होती है, जिसकी मृत्यु दर 100% तक होती है। वर्तमान में, आपातकालीन वैक्सीन और इम्युनोग्लोबुलिन टीकाकरण के अलावा पोस्ट-एक्सपोज़र (यानी त्वचा और श्लेष्म झिल्ली को नुकसान) के लिए कोई प्रभावी उपचार नहीं है। मनुष्यों में रेबीज का मुख्य स्रोत रोगग्रस्त या संभावित रूप से संक्रमित जानवरों (मुख्य रूप से कुत्तों) के काटने से होता है। चीन में रेबीज की मृत्यु दर दुनिया में दूसरे स्थान पर है, और रेबीज हमारे देश में सार्वजनिक स्वास्थ्य सुरक्षा को खतरे में डालने वाली समस्याओं में से एक है। रेबीज वायरस का कैप्सूलर ग्लाइकोप्रोटीन, जो एकमात्र प्रमुख एंटीजन है जो सुरक्षात्मक न्यूट्रलाइजिंग एंटीबॉडी के उत्पादन को प्रेरित करता है, रेबीज वायरस के नए टीकों और नई निदान और उपचार तकनीकों के अनुसंधान और विकास का केंद्र रहा है।

 

रेबीज वायरस रेबडोवायरस परिवार के रेबीज वायरस जीनस से संबंधित है। न्यूक्लियोकैप्सिड का आकार लोचदार होता है, न्यूक्लियोकैप्सिड सर्पिल सममित होता है, और सतह पर एकल-फंसे आरएनए युक्त एक लिफाफा होता है। यह रोगजनक है जो रेबीज का कारण बनता है। रेबीज वायरस के दो मुख्य एंटीजन होते हैं: एक वायरस की बाहरी झिल्ली पर ग्लाइकोप्रोटीन एंटीजन होता है, जो एसिटाइलकोलाइन रिसेप्टर से बंध कर वायरस को न्यूरोटॉक्सिक बना सकता है, और शरीर में न्यूट्रलाइजिंग एंटीबॉडी और हेमग्लूटिनेशन अवरोधक एंटीबॉडी का उत्पादन कर सकता है, और न्यूट्रलाइजिंग एंटीबॉडी का सुरक्षात्मक प्रभाव होता है; दूसरा आंतरिक राइबोप्रोटीन एंटीजन होता है, जो शरीर को पूरक बंधन एंटीबॉडी और प्रीसिपिटिन का उत्पादन कर सकता है, और इसका कोई सुरक्षात्मक प्रभाव नहीं होता है।

 

एंडोटॉक्सिन एक प्रकार का लिपोपॉलीसेकेराइड पदार्थ (LPS) है, जिसमें ऊष्मा प्रतिरोध और रासायनिक स्थिरता होती है और इसे नष्ट करना आसान नहीं होता है। यदि वैक्सीन में एंडोटॉक्सिन की एक निश्चित सांद्रता है, तो यह टीकाकरण के बाद गंभीर बुखार और यहां तक ​​कि मृत्यु का कारण बन सकता है, इसलिए वैक्सीन में एंडोटॉक्सिन की मात्रा को यथासंभव कम किया जाना चाहिए। चीनी फार्माकोपिया (भाग III) के 2005 संस्करण ने निर्धारित किया कि रेबीज वैक्सीन एंडोटॉक्सिन के योग्य सूचकांक का नियंत्रण मूल्य 100EU / खुराक से अधिक नहीं होना चाहिए। झिल्ली पृथक्करण प्रौद्योगिकी के तेजी से विकास के साथ, टीकों में एंडोटॉक्सिन की सामग्री को कम करने के लिए अल्ट्राफिल्ट्रेशन झिल्ली पृथक्करण तकनीक का अनुप्रयोग दवा उद्योग में अधिक से अधिक व्यापक होता जा रहा है।

 

रेबीज वैक्सीन रेबीज के खिलाफ एक वैक्सीन है। आमतौर पर रेबीज वैक्सीन के तीन प्रकार होते हैं, जिसमें शुद्ध वेरो सेल वैक्सीन, मानव द्विगुणित सेल वैक्सीन और प्राथमिक सेल कल्चर वैक्सीन शामिल हैं। रेबीज वैक्सीन को सेल्युलर मैट्रिक्स में रेबीज वायरस के स्थिर वायरस को टीका लगाकर, कल्चर, हार्वेस्ट, सांद्रता, निष्क्रियता, शुद्धिकरण और उचित स्टेबलाइज़र जोड़ने के बाद बनाया जाता है। रेबीज वैक्सीन का मुख्य कार्य शरीर को तेजी से प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया उत्पन्न करने और रेबीज वायरस के खिलाफ सुरक्षात्मक एंटीबॉडी का उत्पादन करने के लिए उत्तेजित करना है, ताकि वायरस के कारण होने वाले संक्रमण को रोका जा सके और बीमारी के जोखिम को कम किया जा सके।

 

 

वैक्सीन की उत्पादन प्रक्रिया वैक्सीन की गुणवत्ता सुनिश्चित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है, विशेष रूप से उत्पादन प्रक्रिया में कुछ संकेतकों का परिमाणीकरण अधिक महत्वपूर्ण है। मानव रेबीज वैक्सीन की उत्पादन प्रक्रिया में, अल्ट्राफिल्ट्रेशन सांद्रता तकनीक मानव रेबीज वैक्सीन का उत्पादन करने के लिए एक आवश्यक साधन है। अल्ट्राफिल्ट्रेशन सांद्रता के लिए उचित एपर्चर अल्ट्राफिल्ट्रेशन झिल्ली का उपयोग करके एंडोटॉक्सिन और मेजबान प्रोटीन को प्रभावी ढंग से हटाया जा सकता है, और आरवी एंटीजन को बनाए रखा जा सकता है, जो वैक्सीन उत्पादन और गुणवत्ता सुधार के लिए अनुकूल है। आरवी अणुओं का सापेक्ष आणविक द्रव्यमान 350kDa ~ 460kDa है, और सिद्धांत रूप में, आरवी को 100kDa और 300kDa के अवरोधन आणविक भार के साथ झिल्ली कैसेट का उपयोग करके अल्ट्राफिल्ट्रेशन सांद्रता द्वारा पूरी तरह से फंसाया जा सकता है। एंडोटॉक्सिन अक्सर विभिन्न जलीय घोलों में एकत्रित संरचना बनाता है, क्योंकि एकत्रीकरण की डिग्री के कारण, आणविक आकार अलग-अलग होते हैं। एंडोटॉक्सिन मोनोमर का सापेक्ष आणविक द्रव्यमान 10kDa ~ 20kDa है, और इसके पोलीमराइजेशन फॉर्म का सापेक्ष आणविक द्रव्यमान 300kDa ~ 1000kDa या 1000kDa से अधिक है। आणविक भार में अंतर के आधार पर, मानव रेबीज वैक्सीन में RV एंटीजन को बनाए रखा गया और मानव रेबीज वैक्सीन में एंडोटॉक्सिन और होस्ट प्रोटीन को 300kDa अल्ट्राफिल्ट्रेशन झिल्ली द्वारा हटा दिया गया।

 

इस प्रयोग में, 300kDa एपर्चर और 0.11m2 झिल्ली क्षेत्र के साथ अल्ट्राफिल्ट्रेशन झिल्ली कैसेट का उपयोग मानव रेबीज वैक्सीन मध्यवर्ती उत्पादों को केंद्रित करने के लिए छोटे नमूना उपचार के रूप में किया गया था, और झिल्ली प्रवाह, उपचार दक्षता, एकाग्रता गुणक, एंटीजन अवरोधन, एंडोटॉक्सिन हटाने और मेजबान प्रोटीन हटाने का परीक्षण किया गया था।

 

2सामग्री विधि

 

2.1 प्रायोगिक सामग्री

रेबीज वायरस फिक्स्ड वायरस CTN-IV स्ट्रेन; वेरो कोशिकाएं; 0.5M सोडियम हाइड्रोक्साइड; 300kDa अल्ट्राफिल्ट्रेशन झिल्ली कैसेट (PES सामग्री, 0.11m² झिल्ली क्षेत्र)।

 

2.2 प्रायोगिक विधियाँ

2.2.1 वायरस हार्वेस्टिंग समाधान की तैयारी

जमे हुए वेरो कोशिकाओं को 37 डिग्री ~ 39 डिग्री पर गर्म पानी में पुनर्जीवित किया गया, सेल सस्पेंशन को बाहर निकाला गया, और फिर 199 कल्चर मीडियम में जोड़ा गया जिसमें 10% निष्क्रिय बछड़ा सीरम था। एकसमान मोनोलेयर कोशिकाओं को 37 डिग्री पर संवर्धित किया गया। CTN-IV स्ट्रेन को रेबीज वायरस के साथ 0.1mol/L के अनुपात में टीका लगाया गया और 37 डिग्री पर संवर्धित किया गया। 48 घंटे के बाद, कल्चर मीडियम को त्याग दिया गया और 199 कल्चर मीडियम में 0.1% मानव रक्त एल्ब्यूमिन मिलाया गया ताकि कल्चर को 33 डिग्री ~ 35 डिग्री पर बनाए रखा जा सके। हर 3 दिन में एक बार रोग विष को इकट्ठा करें और कई कटाई तरल पदार्थों को मिलाएं।

 

2.2.2 मेम्ब्रेन कैसेट स्थापित करना

झिल्ली कैसेट स्थापित करें और तारों को कनेक्ट करें जैसा कि नीचे चित्र में दिखाया गया है।

 

2.2.3 जल धुलाई

इनलेट वाल्व, रिटर्न वाल्व और थ्रू वाल्व को बंद करें, और रिटर्न एंड और थ्रू एंड पाइप को अपशिष्ट तरल टैंक में डालें। इंजेक्शन के लिए इनटेक टैंक को 1 लीटर पानी से भरें।

इनलेट और रिटर्न वाल्व खोलें, थ्रू वाल्व बंद करें, पंप खोलें, रिटर्न लाइन को 1% शुद्ध पानी या इंजेक्शन के लिए पानी से साफ करें, और इनलेट दबाव को 0.35bar (5psi) पर बनाए रखें।

फिल्टर वाल्व खोलें, रिटर्न वाल्व बंद करें, और फिल्टर पाइप को साफ करने के लिए शेष इंजेक्शन पानी का उपयोग करें, TMP को 0.35bar पर बनाए रखें।

 

2.2.4 कीटाणुशोधन

इनलेट वाल्व, रिटर्न वाल्व और ट्रांसमिशन वाल्व को बंद करें, और रिटर्न एंड और ट्रांसमिशन एंड लाइनों को अपशिष्ट तरल टैंक में डालें। इनटेक टैंक को 2L सफाई समाधान से भरें।

इनलेट और रिटर्न वाल्व खोलें, थ्रू वाल्व बंद करें, पंप खोलें, रिटर्न लाइन को 0.5M सोडियम हाइड्रोक्साइड के 200mL से साफ करें, और इनलेट दबाव को 0.35bar (5psi) पर बनाए रखें।

थ्रू वाल्व खोलें, रिटर्न वाल्व बंद करें, और थ्रू पाइप को 200mL मात्रा के सफाई घोल से साफ करें, TMP को 0.35bar पर बनाए रखें।

फिर वापसी छोर और थ्रू छोर पाइप को चक्रीय सफाई के लिए तरल टैंक में डाला जाता है। 30 मिनट के लिए प्रक्रिया स्पर्शीय प्रवाह दर के 1 ~ 1.5 गुना के साथ चक्रीय सफाई।

0.5M सोडियम हाइड्रोक्साइड को निकाल दें और 2.2.4 के अनुसार इंजेक्शन के लिए पानी से तब तक धोएं जब तक कि वह उदासीन न हो जाए।

 

2.2.5 जल फ्लक्स परीक्षण

सेवन टैंक में शुद्ध पानी डालें, सेवन टैंक में पानी का तापमान मापें और रिकॉर्ड करें। टैंक में वापसी छोर डालें। पंप चालू करें और 0.35bar (5psi) ट्रांसमेम्ब्रेन दबाव अंतर प्राप्त करने के लिए पंप की गति और वापसी वाल्व को समायोजित करें। सिलेंडर का उपयोग करके, थ्रू-एंड पर प्रवाह दर को mL/min में मापें और रिकॉर्ड करें। 1bar (15psi) ट्रांसमेम्ब्रेन अंतर दबाव प्राप्त करने के लिए पंप की गति और वापसी वाल्व को समायोजित करें। सिलेंडर का उपयोग करके, थ्रू-एंड पर प्रवाह दर को mL/min में मापें और रिकॉर्ड करें।

जल प्रवाह मान को मानकीकृत करने के लिए, गणना किए गए जल प्रवाह मान को ट्रांसमेम्ब्रेन दबाव अंतर से विभाजित करें और निम्नलिखित तालिका में तापमान सुधार कारक को गुणा करें।

 

2.2.6 अल्ट्राफिल्ट्रेशन सांद्रता

बफर टॉप से ​​सिस्टम से पानी को धो लें। सिस्टम के pH और आयन स्थिरता को समायोजित करने के लिए 5 मिनट तक साइकिल चलाएं। यदि तापमान को समायोजित करने की आवश्यकता है, तो सिस्टम तापमान स्थिर होने तक साइकिल चलाना जारी रखें।

इनटेक टैंक में फीड लिक्विड डालें, फीड फ्लो रेट (जैसे 400LMH) सेट करें, और अलग-अलग TMP मानों पर थ्रू फ्लो रेट का परीक्षण करें। परीक्षण डेटा के अनुसार, TMP को एब्सिस्सा और फ्लक्स को ऑर्डिनेट के रूप में लेकर वक्र बनाए गए।

थ्रू-एंड पाइप को उपयुक्त कंटेनर या नाली में डालें, जैसे थ्रू-एंड संग्रह टैंक, अपशिष्ट तरल टैंक और प्रक्रिया नालियां।

फ़ीड टैंक में फ़ीड तरल के प्रारंभिक वजन को रिकॉर्ड करें, फ़ीड पंप शुरू करें, और फ़ीड तरल को धीरे-धीरे 3 मिनट से 4 मिनट तक प्रसारित करें। पुनःपरिसंचरण प्रवाह पथ में अवशिष्ट हवा को हटाने में मदद कर सकता है, जिससे फिल्म के प्रदर्शन को अधिकतम किया जा सकता है।

थ्रू वाल्व खोलें, पंप की गति को धीरे-धीरे बढ़ाएं जब तक कि इष्टतम स्पर्शीय प्रवाह दर तक न पहुंच जाए, और सिस्टम के इष्टतम टीएमपी को प्राप्त करने के लिए रिटर्न वाल्व को समायोजित करें।

फिर ट्यूब को संग्रहण कंटेनर में डालें, जब तरल कंटेनर में प्रवेश करता है तो समय लेना शुरू करें, और उचित अंतराल पर इनलेट और वापसी दबाव को रिकॉर्ड करें, और तात्कालिक प्रवाह दर की गणना करने के लिए वापसी छोर और अंत में समय के साथ तरल की गुणवत्ता को रिकॉर्ड करें।

नमूने की अल्ट्राफिल्ट्रेशन सांद्रता तब पूरी हो जाती है जब फ़ीड की तरल मात्रा लक्ष्य सांद्रता मात्रा तक कम हो जाती है।

 

2.2.7 डायलिसिस

सेवन पाइप, पुनःपूर्ति पाइप और वापसी पाइप को सेवन टैंक में डालें, ट्रांसमिशन पाइप को संग्रह कंटेनर में डालें, और संग्रह कंटेनर को साफ़ करने के लिए संतुलन पर रखें।

रिटर्न वाल्व खोलें, इनलेट पंप शुरू करें, थ्रू वाल्व खोलें, पंप की गति और TMP को उचित मूल्य पर समायोजित करें। पुनःपूर्ति पंप खोलें, सेवन टैंक में तरल की मात्रा को अपरिवर्तित रखें, और समान मात्रा डायलिसिस शुरू करें। जब तरल कंटेनर में प्रवेश करता है, तो समय शुरू करें, और उचित समय अंतराल पर इनलेट छोर, रिटर्न छोर और तरल के द्रव्यमान पर दबाव रिकॉर्ड करें, और गणना करके तात्कालिक प्रवाह दर प्राप्त करें।

 

2.2.8 सीआईपी

पहले बफर से धोएँ, फिर इंजेक्शन के लिए पानी से धोएँ (ऑपरेशन 2.2.3), फिर सफाई एजेंट से साफ करें (ऑपरेशन 2.2.4), और अंत में इंजेक्शन के लिए पानी से धोएँ (ऑपरेशन 2.2.3)।

 

2.2.9 जल फ्लक्स परीक्षण

ऑपरेशन इस प्रकार है: 2.4.5.

 

2.2.10 झिल्ली कैसेट का संरक्षण

अल्पावधि भंडारण (3 दिन से कम या बराबर), झिल्ली कैसेट को स्थिरता में रखें और भंडारण समाधान का उपयोग 10 मिनट से 15 मिनट तक चक्र करने के लिए करें, सिस्टम वाल्व को बंद करें, तरल पंप को बिजली की आपूर्ति काट दें, और सुनिश्चित करें कि तरल इनलेट टैंक सही ढंग से सील हो।

यदि भंडारण समय 3 दिन से 1 महीने तक है, तो कृपया फिक्सचर से मेम्ब्रेन कैसेट को हटा दें और इसे प्लास्टिक बैग या अन्य एयरटाइट कंटेनर में सील कर दें। एक प्लास्टिक बैग या एयरटाइट कंटेनर में लगभग 50mL से 100mL स्टोरेज सॉल्यूशन डालें और इसे सील कर दें। या इसे सीधे स्टोरेज सॉल्यूशन में डुबोया जा सकता है। निम्न तालिका भंडारण की स्थिति की सिफारिश करती है।

 

3 परिणाम और विश्लेषण

 

3.1 पाइरोजेन निष्कासन दक्षता को प्रभावित करने वाले कारकों की जांच

अल्ट्राफिल्ट्रेशन ऑपरेशन प्रेशर: 15 टेस्ट बैच लगातार चलाए गए। प्रत्येक बैच में, अल्ट्राफिल्ट्रेशन के दौरान फ़िल्टरेशन प्रेशर 5, 10, 15 और 2{{10}}psi पर बनाए रखा गया था, और वायरस हार्वेस्ट लिक्विड को 30 बार सांद्रित किया गया था और निरंतर प्रवाह में बफर लिक्विड (मात्रा का 10 गुना) के साथ निकाला गया था। नीचे दी गई तालिका में दिखाए गए परिणामों के अनुसार, एंडोटॉक्सिन की निष्कासन दर 87.0% से कम थी, एंटीजन की रिकवरी दर 86.0% पर स्थिर थी, और होस्ट प्रोटीन की निष्कासन दर 90.0% पर स्थिर थी, जो दर्शाता है कि विभिन्न ऑपरेटिंग दबावों का एंटीजन रिकवरी, एंडोटॉक्सिन निष्कासन और होस्ट प्रोटीन निष्कासन के प्रभाव पर बहुत कम प्रभाव था।

अल्ट्राफिल्ट्रेशन सांद्रता अनुपात: 15 परीक्षण बैच लगातार चलाए गए। प्रत्येक बैच में, वायरस हार्वेस्ट तरल को अल्ट्राफिल्ट्रेशन के दौरान क्रमशः 30 बार, 50 बार, 80 बार और 100 बार केंद्रित किया गया। निस्पंदन दबाव 20psi पर बनाए रखा गया था, और बफर तरल (मात्रा का 10 गुना) निरंतर प्रवाह में निकाला गया था। परिणाम निम्न तालिका में दिखाए गए हैं, एंडोटॉक्सिन की निष्कासन दर 53.3% से 86.9% तक थी, एंटीजन रिकवरी दर 86.0% पर स्थिर रही, और मेजबान प्रोटीन की निष्कासन दर 91.0% पर स्थिर रही। खंडित नमूने में, संचरण समाधान में कोई एंटीजन नहीं पाया गया, और केंद्रित वायरस समाधान में 10% से कम मेजबान प्रोटीन रह गया। वायरस के सांद्रित घोल में एंडोटॉक्सिन की सांद्रता, सांद्रण समय की वृद्धि के साथ बढ़ी, और सांद्रित नमूने में एंडोटॉक्सिन निष्कासन दर 80 गुना सबसे अधिक थी, और निर्माता 100 गुना की सांद्रता पर भी विचार कर सकता था, जिससे न केवल उत्पादन क्षमता में सुधार हुआ और लागत कम हुई, बल्कि वैक्सीन उत्पादन की आवश्यकताओं को भी पूरा किया गया।

 

3.2 झिल्ली कैसेट फ्लक्स कमी और सफाई पुनर्जनन

उपचार के बाद, झिल्ली प्रवाह वसूली दर 92.6% थी। नए झिल्ली कैसेट की पहली वसूली दर सामान्य है, फ़ीड तरल के वर्तमान अवलोकन गुणों के अनुसार, दूसरे और एनटीएच समय की बाद की भविष्यवाणी, झिल्ली कैसेट प्रवाह वसूली दर इस उपचार के बाद डेटा के करीब होगी, और स्थिर होने की प्रवृत्ति होगी। एकल उपयोग के 2 घंटे के भीतर, झिल्ली कैसेट की कमी आदर्श थी, और समग्र संचालन के तहत झिल्ली प्रवाह का केवल 10% ही समाप्त हुआ था।

3.2.1 झिल्ली कैसेट उपचार की प्रक्रिया में फ्लक्स की कमी

3.2.2 झिल्ली कैसेट की सफाई और पुनर्जनन का परिणाम

 

गाइडलिंग के बारे में

 

गाइडलिंग टेक्नोलॉजी एक राष्ट्रीय उच्च तकनीक उद्यम है जो बायोफार्मास्युटिकल्स, सेल कल्चर, बायोमेडिसिन के शुद्धिकरण और सांद्रता, निदान और औद्योगिक तरल पदार्थों पर ध्यान केंद्रित करता है। हमने सफलतापूर्वक केन्द्रापसारक फ़िल्टर डिवाइस, अल्ट्राफिल्ट्रेशन और माइक्रोफिल्ट्रेशन कैसेट, वायरस फ़िल्टर, TFF सिस्टम, डेप्थ फ़िल्टर, खोखले फाइबर आदि विकसित किए हैं। जो बायोफार्मास्युटिकल्स, सेल कल्चर आदि के अनुप्रयोग परिदृश्यों को पूरी तरह से पूरा करते हैं। हमारी झिल्लियाँ और झिल्ली फ़िल्टर व्यापक रूप से प्री-फ़िल्ट्रेशन, माइक्रोफ़िल्ट्रेशन, अल्ट्राफ़िल्ट्रेशन और नैनोफ़िल्ट्रेशन की सांद्रता, निष्कर्षण और पृथक्करण में उपयोग किए जाते हैं। हमारी कई उत्पाद लाइनें, छोटे, एकल-उपयोग प्रयोगशाला निस्पंदन से लेकर उत्पादन निस्पंदन प्रणाली, बाँझपन परीक्षण, किण्वन, सेल संस्कृति और बहुत कुछ, परीक्षण और उत्पादन की जरूरतों को पूरा करती हैं। गाइडलिंग टेक्नोलॉजी आपके साथ सहयोग करने के लिए तत्पर है!